家养动物细胞体外培养原理与技术PDF电子书下载

第一章 绪论 1

第一节 国内外细胞培养技术发展概述 1

第二节 国内外细胞库现状概述 4

第二章 动物细胞体外培养的基本理论 8

第一节 体外培养动物细胞生物学 8

一、体外培养细胞的特征 8

（一）形态学特征 9

1．贴附型 9

2．悬浮型 10

（二）遗传学特征 11

1．核型变化 11

2．永生化和恶变 11

3．细胞性别 12

（三）生长特征 12

1．贴附并伸展 13

2．接触抑制 13

3．密度抑制 13

二、体外培养动物细胞的生长与增殖 14

（一）单个细胞的生长过程 14

1．G1期 14

2．S期 14

3．G2期 14

4．M期 14

（二）细胞系的生长过程 15

1．原代培养期 16

2．传代培养期 18

3．衰退期 19

（三）每代细胞的生长过程 19

1．潜伏期 20

2．指数生长期 20

3．停滞期 21

4．衰亡期 21

三、体内外细胞分化特点 23

（一）体内外细胞的差异 23

（二）培养细胞分化状态的变化 23

（三）培养细胞的分化 24

1．不适应 24

2．脱分化或去分化 25

第二节 影响动物细胞体外生长的因素 26

一、组织和细胞供体年龄 26

二、细胞生存条件和环境 26

（一）无菌环境对细胞生长的影响 26

（二）培养基成分对细胞生长的影响 26

1．水 27

2．氨基酸 27

3．碳水化合物 27

4．无机离子 28

5．维生素 29

6．有机酸 31

7．有机补充物 31

8．促生长因子及激素 31

9．黏滞度 32

10．抗生素 32

（三）培养基的pH对细胞生长的影响 33

（四）温度条件对细胞生长的影响 33

1．生理温度范围 33

2．高温的影响 34

3．低温的影响 35

4．渗透压 35

5．气相环境 35

6．贴附底物 36

7．辐射 38

8．超声波 39

9．影响细胞生长的其他因素 39

第三节 细胞系或细胞株的构建 40

一、基本概念 40

二、所建细胞系（株）的档案信息 41

（一）培养细胞的来源 41

（二）细胞生物学特性 41

（三）培养条件和方法 42

三、细胞系（株）的鉴定 42

（一）细胞系鉴定的内容 42

1．细胞系的纯度 42

2．细胞学特征 42

3．细胞系的稳定性 42

4．微生物污染检查 42

5．细胞系（株）交叉污染检查 42

（二）细胞系鉴定的方法 43

1．形态学鉴定 43

2．细胞核型分析 43

3．细胞DNA指纹技术检测 43

4．同工酶检测 44

5．抗原标记 44

6．细胞生长实验 45

（三）细胞系鉴定的结论 45

1．组织来源 45

2．培养条件及方法 45

3．染色体核型分析鉴定 45

4．细胞生长情况 45

5．细胞生物学检测 46

6．细胞的冻存与复苏 46

7．细胞有无交叉污染 46

8．细胞系有无微生物污染 46

四、细胞系的命名 46

第三章 动物细胞体外培养的设施和基本条件 47

第一节 实验室设计 47

一、设计原则 47

二、设计方案 47

第二节 实验室布局 48

一、无菌操作室 48

二、清洗准备区 49

（一）洗涤区 49

（二）灭菌区 49

（三）储藏区 50

（四）试剂配制区 50

三、低温储存区 50

第三节 实验室设备器材 50

一、必需设备 51

（一）超净工作台 51

（二）培养箱 52

（三）倒置显微镜 53

（四）高压蒸汽灭菌装置 53

（五）电热干燥箱 54

（六）水纯化装置 54

1．金属蒸馏器具 54

2．石英玻璃蒸馏器 54

3．去离子水纯化装置 55

4．超纯水装置 56

（七）离心机 56

（八）冰箱 56

（九）天平 56

（十）冷冻储存装置 57

（十一）过滤除菌装置 58

1．不锈钢板式滤器 58

2．玻璃漏斗式滤器 59

3．微孔滤膜滤器 59

（十二）洗刷装置 60

（十三）恒温水浴锅 60

（十四）细胞计数板 61

二、辅助设备 61

（一）移液装置 61

1．电动移液器 61

2．微量移液器 61

3．多通道可调式微量移液器 62

4．连续加液装置 62

（二）电子细胞计数仪 62

（三）pH计 63

（四）显微操作仪 63

（五）细胞融合仪 63

（六）磁力搅拌器 64

三、常用耗材 64

（一）手术器械 64

（二）培养器皿 64

1．溶液瓶 65

2．培养瓶 65

3．培养皿 65

4．多孔培养板 66

5．移液管和吸管 66

6．离心管 66

7．其他器皿 66

（三）注射器和针头 66

（四）滤膜 66

第四章 动物细胞体外培养用液 67

第一节 水和平衡盐溶液 67

一、水 67

二、平衡盐溶液 67

（一）BSS液的类别 68

1．配制培养液用BSS 68

2．分散消化用BSS 68

（二）BSS的制备 68

第二节 培养基 69

一、天然培养基 69

（一）血浆 70

（二）血清 70

1．血清的种类 70

2．血清的主要成分及主要作用 71

3．细胞培养中使用血清的主要优点 73

4．细胞培养中使用血清的缺点 73

5．血清的质量标准 75

6．牛血清产品的质量鉴定 76

7．血清的使用与储存 77

8．血清使用的注意事项 77

（三）水解乳蛋白 78

（四）胶原 78

1．鼠尾胶原的制备方法 79

2．胶原的使用方法 79

（五）胚胎浸出液 79

二、合成培养基 80

（一）合成培养基的种类 81

1．Eagle MEM 85

2．DMEM 85

3．IMDM 85

4．RPMI 1640 86

5．199、109培养基 86

6．HamF10、HamF12 86

7．McCoy 5A 86

（二）合成培养基的主要成分 86

1．氨基酸 87

2．维生素 87

3．碳水化合物 87

4．无机离子 87

5．其他成分 88

（三）合成培养液的配制 88

（四）培养液的分类 89

1．生长培养液 89

2．维持液 89

三、培养基和血清的选择 89

（一）培养基的选择 89

1．经验法 90

2．实验法 90

（二）对血清的选择 90

1．血清批号差异和检测 90

2．灭活问题 91

四、无血清培养基 91

（一）无血清培养液的特点 92

1．无血清培养液的优点 92

2．无血清培养液的缺点 92

（二）无血清培养基的设计思路 93

1．分析血清的成分 93

2．采用合成的方法 93

3．寻找限制因素 93

（三）无血清培养基的组成成分 93

1．基础培养基 93

2．附加成分 94

（四）无血清培养基的制备 96

五、无蛋白培养基和限定化学成分培养基 97

第三节 动物细胞体外培养的其他常用液 98

一、其他常用液类型 98

（一）消化液 98

1．胰蛋白酶液 98

2．胶原酶溶液 98

3．EDTA溶液 99

（二）pH调整液 100

1．NaHCO3溶液 100

2．HEPES溶液 100

（三）抗生素液 100

（四）冷冻保护剂 101

（五）谷氨酰胺补充液 102

二、几种常用液的具体配制 102

（一）0.25％胰蛋白酶溶液 102

（二）0.02％EDTA溶液 102

（三）0.05％胰蛋白酶-0.53 mmol/L EDTA·4Na溶液 103

（四）5.6％NaHCO3溶液 103

（五）1 mol/L HEPES缓冲液 103

（六）青霉素／链霉素溶液（100倍浓度） 103

（七）200 mmol/L谷氨酰氨液（100倍浓度） 103

（八）冻存液 103

第五章 培养器皿的清洗、消毒与灭菌 106

第一节 清洗 106

一、玻璃器皿的清洗 106

（一）浸泡 106

（二）刷洗 107

（三）浸酸 107

（四）冲洗 107

二、塑料器皿的清洗 108

三、橡胶制品的清洗 109

四、金属器皿的清洗 110

五、除菌滤器的清洗 110

（一）玻璃漏斗滤器 110

（二）蔡氏滤器 110

（三）注射器薄膜滤器 110

六、器皿包装 111

第二节 消毒灭菌 111

一、物理消毒灭菌方法 112

（一）热力灭菌 113

1．高温湿热灭菌 113

2．高温干热灭菌 115

（二）辐射灭菌法 115

1．紫外线杀菌 115

2．电离辐射灭菌 116

3．微波灭菌 116

（三）滤过除菌 116

（四）超声波杀菌 116

（五）干燥与低温抑菌 117

二、化学消毒灭菌方法 118

（一）化学消毒灭菌的机理 118

1．使菌体蛋白变性、凝固 118

2．破坏细菌的细胞膜 118

3．干扰细菌的酶系统 118

（二）化学消毒灭菌方法 118

1．浸泡法 118

2．擦拭法 118

3．熏蒸法 119

4．喷雾法 119

（三）化学消毒剂的分类 119

（四）细胞培养工作中常用的几种消毒灭菌剂 121

1．苯扎溴铵（新洁尔灭） 121

2．过氧乙酸 121

3．戊二醛 122

4．乙醇 122

5．环氧乙烷 123

6．二溴海因 123

三、抗生素消毒灭菌 124

四、影响消毒灭菌效果的因素 124

（一）消毒剂量 124

（二）微生物的种类和数量 124

（三）温度 125

（四）相对湿度 125

（五）酸碱度 125

（六）有机物质 125

（七）拮抗物质 125

第三节 清洁剂、消毒剂的选择 126

一、清洁剂的选择 126

二、消毒剂的选择 126

（一）消毒剂的选择原则 126

（二）消毒剂的选择 126

第六章 实验室安全问题 128

第一节 危险事故和防范 128

一、人身危险 129

（一）外伤 129

（二）中毒 129

（三）触电 129

二、广泛性危险 129

（一）火灾 129

（二）有害物播散 129

三、实验事故 130

（一）仪器损坏 130

（二）放射性物质 130

1．摄入 130

2．标记的试剂 130

3．高能源 130

（三）激光辐射 131

（四）液氮 131

（五）紫外光或紫外线 131

（六）高压灭菌锅和微波炉 131

（七）针剪器械 131

（八）血液和血液制品 132

（九）细菌菌株的运输有关事宜 132

第二节 安全清单 132

一、实验室建筑 133

二、储存设施 134

三、环境卫生和个人卫生设施 134

四、暖气和通风 134

五、照明 135

六、保养 135

七、安全 135

八、消防 135

九、易燃液体的储存 136

十、电的危险 136

十一、压缩气体和液化气 136

十二、个体防护 137

十三、实验室成员的健康与安全 137

十四、实验室仪器设备 138

十五、感染性物质 138

十六、化学试剂和放射性物质 138

第三节 危害性化学试剂 139

一、化学试剂的毒性作用 139

二、危害途径 140

1．吸入 140

2．接触 140

3．食入 140

4．外伤 140

三、化学试剂的储存 140

四、不能共存的化学试剂 140

第七章 无菌技术 147

第一节 无菌环境的维持 147

一、工作环境 147

二、工作台面 148

三、试剂与培养基 148

四、培养细胞所用器具 149

五、个人卫生 149

第二节 无菌操作的具体要求 149

一、仪器和设备的无菌操作 149

（一）培养箱 149

（二）装取培养物 150

（三）超净工作台 150

二、超净工作台内的无菌操作 151

（一）培养前的准备工作 151

（二）用消毒液擦拭操作台 151

（三）灼烧 151

（四）试剂瓶和培养瓶的操作 151

（五）移液 151

（六）倾倒液体 152

（七）加盖 152

（八）培养皿和培养板的操作 152

三、实例——在超净工作台内进行无菌操作添加培养基 153

（一）实验材料 153

（二）操作步骤 153

第八章 家养动物细胞体外培养的基本方法 155

第一节 家养动物细胞培养技术 155

一、贴壁培养 156

（一）基本原理 156

（二）试剂和设备 156

（三）操作步骤 156

（四）说明 157

（五）贴壁培养的讨论 157

二、悬浮培养 157

（一）操作步骤 158

（二）悬浮培养的讨论 158

第二节 取材与组织分离 158

一、采样前的准备 158

（一）准备工作 158

1．实验室硬件的准备 158

2．培养用液的准备 159

3．清洗准备 159

4．灭菌消毒准备 159

5．采样器具的准备 159

6．冻存细胞准备 160

7．实验室消毒准备 160

（二）准备步骤举例 160

二、几类常用实验动物不同部位的取材 161

（一）动物胚胎的取材 161

1．分离鸡胚 161

2．分离鼠胚 162

（二）成体体表组织的取材 163

（三）内脏器官组织的取材 164

（四）血细胞的采集 164

1．割（剪）尾采血 164

2．鼠尾刺血法 164

3．眼眶静脉丛采血 165

4．断头取血 165

5．心脏采血 165

6．颈静脉采血 165

7．腹主动脉采血 165

8．股动（静）脉采血 165

三、细胞培养的常用操作技术 167

（一）细胞系的接种和传代 167

1．悬浮培养细胞的接种和传代 167

2．贴壁培养细胞的接种和传代 168

（二）细胞的洗脱方法 168

第三节 原代培养 169

一、原代培养的类型 169

（一）组织块原代培养法 169

（二）悬浮细胞原代培养法 171

（三）细胞的无血清培养 172

（四）哺乳动物细胞的大量培养 172

二、分离（散）细胞的方法 173

（一）机械解离细胞法 174

1．离心分离法 174

2．切割分离法 174

3．机械分散法 174

（二）酶学解离细胞法 174

1．胰蛋白酶解离细胞法 175

2．胶原酶解离细胞法 176

（三）螯合剂解离细胞法 177

1．操作步骤 177

2．讨论及注意事项 178

3．培养结果 179

三、原代细胞培养的注意事项 179

（一）培养液 179

1．培养基的选择 179

2．添加物 179

3．培养液的酸碱度 179

4．换液 180

（二）培养空间 180

（三）其他方面 180

第四节 传代培养 181

一、传代过程 181

（一）材料 181

1．蛋白酶消化液 181

2．蛋白酶抑制剂 182

3．培养器皿 182

4．培养液及平衡盐溶液 182

（二）传代过程 182

1．第一次传代 182

2．常规传代 183

二、传代培养的注意事项 184

（一）传代的时机与再培养的细胞密度 184

（二）传代数或代数与培养物的生长 184

第五节 细胞的冻存、复苏与运输 185

一、细胞的低温冻存 185

（一）细胞冻存的步骤 186

（二）细胞系的维持 187

二、冻存细胞的复苏 187

（一）用品 188

（二）步骤 188

（三）注意事项 188

三、细胞培养物冻存和复苏中的安全措施 188

四、细胞的运输 189

第九章 家养动物组织细胞体外培养技术 190

第一节 上皮组织的细胞培养 190

一、内皮细胞的培养 190

（一）血管内皮细胞的培养 190

1．血管内皮细胞的分离 191

2．血管内皮细胞的培养 193

3．内皮细胞的传代、冻存与复苏 193

4．血管内皮细胞的鉴定 193

5．注意事项 194

（二）淋巴管内皮细胞的培养 195

1．灌注消化法 195

2．植块培养法 196

二、单层柱状上皮细胞的培养 196

（一）胃黏膜上皮细胞的培养 196

1．材料 196

2．操作步骤 197

3．结果分析 197

4．胃黏膜上皮细胞的鉴定 197

（二）肠黏膜上皮细胞的培养 197

1．材料 198

2．操作步骤 198

3．结果分析 198

4．肠黏膜上皮细胞的鉴定 198

5．注意事项 199

（三）子宫颈部上皮细胞培养 199

1．材料 199

2．操作步骤 200

三、假复层纤毛柱状上皮细胞的培养 201

（一）灌注消化法 202

1．材料 202

2．操作程序 202

3．结果分析 202

（二）组织块培养法 202

1．材料 202

2．操作程序 203

3．结果分析 203

（三）分化培养 203

1．材料 203

2．操作程序 203

3．结果分析 203

四、复层扁平上皮细胞的培养 204

（一）表皮细胞的培养 204

1．角质形成细胞的分离培养 204

2．真皮复合培养法 205

3．真皮替代物复合培养法 205

4．角膜上皮细胞培养 206

（二）食管黏膜上皮细胞的培养 207

1．材料 208

2．操作程序 208

3．结果分析与鉴定 208

4．注意事项 208

（三）腺上皮细胞培养 208

1．乳腺上皮细胞的培养 209

2．从乳汁中获得乳腺上皮细胞的培养 211

第二节 结缔组织的体外培养 212

一、成纤维细胞的培养 212

（一）动物真皮成纤维细胞的培养 212

1．材料 212

2．操作步骤 212

3．培养结果及鉴定 213

（二）鸡胚成纤维细胞的培养 213

1．材料 213

2．操作步骤 214

二、巨噬细胞培养 214

1．材料 214

2．操作步骤 215

3．结果与鉴定 215

4．注意事项 215

三、肥大细胞的培养 216

（一）皮肤肥大细胞的培养 216

1．材料 216

2．操作程序 216

3．结果与鉴定 217

（二）肺肥大细胞的培养 217

1．材料 217

2．操作步骤 217

3．结果分析 218

（三）肠肥大细胞的培养 218

1．材料 218

2．操作程序 218

3．结果分析 219

四、前脂肪细胞的培养 219

1．实验材料 219

2．操作步骤 220

3．实验结果与鉴定 220

第三节 淋巴细胞的培养 220

一、血细胞和淋巴细胞的发生和分类 220

（一）血细胞的发生 220

（二）血细胞的分类 221

1．红细胞 222

2．白细胞 222

3．血小板 223

（三）淋巴细胞的分类 223

1．T淋巴细胞 224

2．B淋巴细胞 224

3．大颗粒淋巴细胞 225

二、淋巴细胞的收集 225

（一）淋巴液中淋巴细胞的收集 225

1．实验材料 225

2．操作步骤 226

3．结果分析 226

4．注意事项 226

（二）淋巴结中淋巴细胞的收集 226

1．实验材料 227

2．操作步骤 227

3．结果分析 227

4．注意事项 227

（三）血中淋巴细胞的收集 227

1．实验材料 228

2．操作步骤 228

3．注意事项 228

三、淋巴细胞的分离 229

（一）淋巴细胞的纯化 229

1．玻璃黏附法 229

2．羰基铁粉法 229

（二）T细胞和B细胞的分离 230

1．尼龙毛柱分离法 231

2．T细胞花环沉降法 232

四、淋巴细胞的培养 233

（一）淋巴细胞转化试验 233

1．实验材料 234

2．操作步骤 234

3．结果分析 235

4．讨论 235

（二）淋巴细胞的体外长期培养 235

1．用IL-2建立T淋巴细胞克隆 235

2．EB病毒转化B淋巴细胞 236

第四节 骨与软骨组织的体外培养 237

一、成骨细胞的培养 237

（一）骨内成骨细胞的培养 237

1．实验材料 237

2．操作步骤 238

3．结果分析 239

4．注意事项 239

（二）骨膜内成骨细胞培养 240

1．实验材料 240

2．操作步骤 240

3．结果与讨论 240

二、破骨细胞的培养 241

（一）成熟破骨细胞分离培养法 241

1．实验材料 241

2．操作步骤 241

3．培养结果 242

4．培养破骨细胞的鉴定 242

5．讨论 243

（二）骨髓长时间培养诱导分化形成破骨细胞法 243

1．实验材料 243

2．操作步骤 243

3．结果与讨论 244

三、软骨细胞的培养 244

（一）关节软骨细胞的短期培养 245

1．实验材料 245

2．操作步骤 245

3．结果分析 246

4．讨论 246

（二）关节软骨细胞的长期培养 246

1．实验材料 247

2．操作步骤 247

3．结果分析 247

4．注意事项 248

四、滑膜细胞的培养 248

（一）滑膜植块培养法 248

1．实验材料 248

2．操作步骤 248

3．结果及鉴定 249

（二）分离滑膜细胞培养法 249

1．实验材料 249

2．操作步骤 249

3．细胞纯化 250

4．结果讨论 250

第五节 肌肉组织的体外培养 250

一、骨骼肌细胞的体外培养 251

（一）鸟类骨骼肌细胞的培养 251

1．实验材料 251

2．操作步骤 252

3．结果分析 252

4．注意事项 252

（二）啮齿类动物骨骼肌细胞的培养 253

1．实验材料 253

2．操作步骤 253

3．结果与讨论 253

二、心肌细胞体外培养 254

（一）实验材料 254

1．来源 254

2．手术器械 254

3．清洗液 254

4．消化液 254

5．培养液 254

（二）操作步骤 255

（三）结果分析 255

（四）注意事项 255

三、平滑肌细胞的培养 255

（一）实验材料 256

（二）操作步骤 256

1．分散细胞培养法 256

2．植块培养法 257

（三）结果分析 257

（四）注意事项 257

第六节 神经组织 257

一、神经元的培养 258

（一）实验材料 258

1．来源 258

2．手术器械 258

3．盖玻片 258

4．清洗液 258

5．消化液 258

6．培养液 259

（二）操作步骤 259

（三）结果鉴定 259

（四）讨论 259

1．取材 259

2．培养条件 260

3．操作过程 260

4．关于神经元的纯度 260

二、神经胶质细胞的培养 260

（一）星形胶质细胞的培养 261

1．实验材料 261

2．操作步骤 262

3．结果鉴定 262

4．注意事项 263

（二）少突胶质细胞的培养 263

1．实验材料 263

2．操作步骤 263

3．结果鉴定 264

4．注意事项 264

（三）小胶质细胞的培养 264

1．实验材料 264

2．操作步骤 265

3．结果鉴定 265

（四）施旺细胞的培养 265

1．实验材料 265

2．操作步骤 266

3．结果鉴定 266

4．注意事项 266

（五）黑色素细胞培养 266

1．实验材料 267

2．操作步骤 267

3．结果鉴定 267

第十章 干细胞的培养 268

第一节 概述 268

一、ES细胞的研究概况 270

二、EG细胞的研究概况 270

三、TS细胞的研究概况 270

第二节 胚胎干细胞 272

一、ES细胞的特性 272

（一）全能性 273

（二）种系传递性 273

（三）遗传可操作性 273

二、ES细胞的培养准备 274

（一）分化抑制物的选择 274

1．饲养层 274

2．条件培养基 275

3．分化抑制因子 276

（二）培养基的设计 277

1．基础培养基的选择 277

2．添加物的选择 277

三、ES细胞培养的方法与技术 278

（一）早期胚胎的选择 278

1．选择时间 278

2．选择方法 278

（二）早期胚胎的培养方法概述 278

1．早期胚胎细胞培养 279

2．胚胎与饲养层细胞共同培养 279

3．ICM与饲养层细胞共同培养 279

4．裸胚与饲养层细胞共同培养 279

5．热休克处理胚胎与饲养层共同培养 279

6．切割胚胎培养 279

（三）ES细胞的分离与培养 280

1．饲养层的制备 281

2．ES细胞的培养 284

四、ES细胞的鉴定 290

（一）ES细胞的形态学观察 290

（二）ES细胞的核型分析 291

（三）ES细胞的分化潜能检测 291

1．体外分化 291

2．体内分化 292

3．嵌合体实验 292

4．Oct-4基因表达 292

5．端粒酶活性检测 292

6．克隆动物实验 293

（四）特异性染色 293

1．AKP染色 293

2．免疫荧光标记 294

五、ES细胞的诱导分化 295

（一）基本原理 295

（二）ES细胞体外诱导分化 296

（三）ES细胞诱导分化的基本方法 296

1．单层ES细胞培养和诱导分化 296

2．ES细胞的EB形成和诱导分化 296

（四）ES细胞诱导分化的几种细胞 297

1．造血细胞 297

2．内皮细胞与血管 297

3．神经细胞 298

4．心肌和其他肌肉细胞 298

5．脂肪细胞 298

6．软骨细胞 299

7．胰岛细胞 299

六、诱导分化细胞的永生化 300

七、ES细胞制备嵌合体动物 300

（一）胚胎聚合法 301

（二）显微注射法 301

八、几种动物ES细胞分离与克隆 301

（一）牛ES细胞的分离与克隆 301

1．试剂配制 301

2．操作程序 302

3．结果 302

（二）小鼠ES细胞的分离与克隆 303

1．试剂配制 303

2．操作程序 304

3．结果 304

（三）猪ES细胞的分离与克隆 305

1．试剂配制 305

2．操作过程 306

3．结果 306

（四）猕猴ES细胞的分离与克隆 307

1．试剂配制 307

2．操作程序 307

3．结果 308

（五）羊ES细胞的分离与克隆 308

1．试剂配制 308

2．操作过程 309

3．结果 309

（六）兔ES细胞的分离与克隆 310

1．试剂配制 310

2．操作过程 311

3．结果 312

（七）鸡ES细胞的分离与克隆 312

1．试剂配制 312

2．操作过程 313

3．结果 313

九、ES细胞分离克隆的影响因素 313

（一）遗传背景 313

（二）胚龄 314

（三）饲养层 315

（四）培养基 315

（五）生长、抑制因子 316

（六）培养方式 316

（七）其他因素 316

十、ES培养及分化过程中常见的问题与对策 316

（一）ES细胞培养与克隆 316

1．ES细胞的死亡 316

2．ES细胞的脱离 317

3．ES细胞的分化 317

（二）EB形成 317

1．形成的EB数量少 317

2．形成的EB数量差异大 317

（三）造血分化过程中造血集落形成率低 317

第三节 胚胎生殖细胞 318

一、EG细胞培养的方法与技术 318

（一）早期胚胎生殖腺的选择 318

1．小鼠采用超排卵途径收集胚胎生殖腺 318

2．人早期胚胎生殖腺的采集 318

（二）早期胚胎的培养方法概述 319

1．PGC与饲养层细胞共同培养法 319

2．机械法 319

（三）EG细胞的培养准备 319

1．饲养层细胞的制备 319

2．PGC的分离 319

3．PGC的培养条件 320

二、EG细胞的分离和培养 320

（一）饲养层细胞 320

（二）EG细胞的培养 320

（三）EG细胞的纯化和建系 321

（四）EG细胞的传代、冻存和复苏 321

三、EG细胞的鉴定 321

（一）EG细胞的形态学观察 321

（二）EG细胞的分化潜能检测 321

1．体外分化 321

2．体内分化 322

3．Oct-4基因表达 322

4．嵌合体实验 322

5．端粒酶 322

（三）特异性染色 322

1．AKP染色 322

2．SSEA-1抗原 322

四、EG细胞的诱导分化 323

五、几种动物EG细胞的分离与克隆 323

（一）牛EG细胞的分离与克隆 323

1．试剂配制 323

2．操作过程 324

3．结果 324

（二）猪EG细胞的分离与克隆 325

1．试剂配制 325

2．操作过程 326

3．结果 326

（三）鸡EG细胞的分离与克隆 326

1．试剂配制 326

2．操作过程 327

3．结果 328

六、EG细胞分离克隆的影响因素 328

（一）遗传背景 328

（二）PGC分离时期及分离、收集方法 329

（三）饲养层 329

（四）培养基 329

（五）生长、抑制因子 329

（六）其他因素 330

七、EG细胞全能性发展前景 330

（一）PGC向EG细胞转化 330

（二）EG细胞与ES细胞的关系 330

（三）PGC的应用前景 331

第四节 造血干细胞 331

一、HSC的特性 332

（一）自我更新、自我维持的能力 333

（二）分化能力 333

二、HSC培养的方法与技术 334

（一）HSC的来源 334

1．骨髓 334

2．外周血 334

3．脐带血 334

4．胎儿造血系统 335

5．ES细胞和胚胎EG细胞分化 335

（二）HSC的分离纯化原理 336

（三）免疫磁珠阳性分选法 337

1．材料 337

2．试剂配制 337

3．操作程序 337

三、HSC的鉴定 338

1．人粒单系集落形成单位（CFU-GM）的培养 339

2．红系集落形成单位CFU-E和BFU-E培养 340

3．CFU-Mega的培养 341

四、HSC体外扩增与定向诱导分化 342

五、HSC的细胞表型及其功能测定 343

六、HSC的细胞周期的调控 343

第五节 骨髓间充质干细胞 344

一、MSC的特性 345

二、MSC培养的方法与技术 345

（一）密度梯度离心法 345

1．试剂配制 345

2．操作程序 346

（二）流式细胞仪分离法 346

1．试剂配制 346

2．操作程序 346

三、骨髓MSC鉴定 347

（一）MSC的形态学观察 347

（二）细胞组织化学特征 347

（三）流式细胞学分析 347

四、MSC的体外诱导分化 348

（一）向成骨细胞分化 348

1．试剂配制 348

2．操作程序 348

（二）向脂肪细胞分化 348

1．试剂配制 348

2．操作程序 349

（三）向软骨细胞分化 349

1．试剂配制 349

2．操作程序 349

第六节 神经干细胞 350

一、NSC的特性 350

（一）可塑性 351

（二）自我更新、自我维持的能力 352

二、NSC培养的方法与技术 352

（一）胚胎NSC的培养 352

1．材料 352

2．试剂配制 353

3．神经嵴细胞的培养 354

4．培养物的鉴定及克隆培养 354

5．结果 355

（二）成年脑组织内NSC的培养 355

1．材料 355

2．试剂配制 355

3．培养过程 355

4．结果 355

（三）小鼠脑室膜细胞源NSC的培养 356

1．材料 356

2．试剂配制 356

3．操作程序 356

（四）星形胶质细胞源NSC的培养 357

1．材料 357

2．试剂配制 357

3．操作程序 357

三、NSC的鉴定 357

（一）细胞标志鉴定 357

（二）功能鉴定 358

四、NSC的诱导分化 358

1．材料 358

2．试剂配制 358

3．操作程序 358

五、神经培养的影响因素 359

（一）胶质细胞培养物 359

（二）培养基 359

（三）分离时间 359

（四）神经球的处理 359

六、NSC分化的影响因素 360

第七节 肝干细胞 361

一、肝干细胞的特性 361

（一）双潜能性 361

（二）可塑性 361

二、HOC及其分化 361

三、肝干细胞的鉴定 362

第八节 肌肉干细胞 363

一、肌肉干细胞的特性 363

二、成肌细胞的分离培养及鉴定 364

1．材料 364

2．试剂配制 364

3．操作程序 364

三、肌肉源间充质干细胞的分离培养及鉴定 365

1．材料 365

2．试剂配制 365

3．操作程序 365

第九节 表皮干细胞 366

一、表皮干细胞的特性 366

（一）标记物特异性 366

（二）自我更新、自我维持的能力 367

（三）分化潜能 367

二、表皮干细胞的培养 367

1．材料 367

2．试剂配制 367

3．操作程序 367

三、表皮干细胞培养及分化中的问题 368

第十节 胰岛干细胞 368

一、PSC的特性 369

（一）分化能力 369

（二）特异分子标志 369

二、小鼠PSC的培养 369

（一）从小鼠胰腺导管制备PSC 369

1．材料 369

2．操作程序 369

（二）从小鼠ES系定向诱导分化为PSC 370

1．材料 370

2．操作程序 370

第十一章 肿瘤细胞的体外培养 371

第一节 肿瘤细胞生长的细胞生物学特性 372

一、肿瘤细胞的发生及判断概论 372

二、肿瘤细胞在体外生长的生物学特性 373

（一）生长分裂失去控制（永生性） 373

（二）细胞形态学的变化 373

（三）更高增殖力 374

（四）非锚着生长依赖性 375

（五）染色体数目及核型 375

（六）异质性 375

（七）具有接种致瘤性 376

（八）细胞表面性状特点 377

（九）接触抑制减弱或消失 377

三、肿瘤细胞在体内和体外的生长特征差别 377

（一）生长环境与营养供给 377

（二）形态差异 377

（三）生长环境 377

（四）生长速度 378

第二节 体外培养肿瘤组织细胞的方法和技术 378

一、体外培养肿瘤细胞常用的培养基 378

（一）培养基（液）的种类和选择 378

（二）培养液特殊添加剂 379

二、肿瘤组织细胞的原代培养 379

（一）取材 379

（二）培养方法 380

1．植块培养 380

2．分离（散）细胞培养 380

3．原代培养的一般结果 381

4．肿瘤细胞原代培养注意事项 383

三、肿瘤细胞的传代培养 383

四、肿瘤细胞的克隆培养法 384

（一）集落克隆法 384

1．不锈钢圈法 385

2．滤纸法 385

3．吸管吹打法 385

（二）单个细胞克隆培养法 386

1．有限稀释法 386

2．毛细管分离法 386

3．盖玻片法 386

第三节 体外培养肿瘤细胞的生物学检测 387

一、组织起源 387

二、细胞形态观察 387

三、细胞生长特征 387

四、核型分析 388

（一）获得中期分裂相细胞 388

（二）收集分裂细胞 388

（三）低渗处理 388

（四）固定 388

（五）制片 388

（六）染色 388

五、软琼脂培养 388

1．琼脂制备 389

2．将2×DME（含有2倍抗生素和20％CS）保存在37℃水浴中 389

3．制备琼脂糖底层 389

4．制备琼脂顶层 389

5．上层琼脂凝固后，置37℃、5％CO2培养箱中培养10～14 389

6．细胞集落 389

六、异种移植法 389

（一）宿主的选择 389

（二）肿瘤细胞接种试验 390

第四节 肿瘤细胞系的建立与保存 390

一、肿瘤细胞的保存 390

二、细胞系（株）建立过程中存在的问题 390

第十二章 细胞培养过程中的污染的检测、消除和预防 392

第一节 污染的种类和途径 392

一、环境 393

二、技术 393

三、仪器设备和装置 393

（一）超净工作台 393

（二）潮湿培养箱 393

（三）培养器皿及容器 393

（四）冷冻储存 394

四、材料和试剂 394

（一）无菌材料 394

（二）组织样本 394

（三）血清 394

（四）水 394

（五）培养液、培养附加成分、试剂 395

五、生物材料的传入 395

第二节 污染对细胞的影响及检测 395

一、微生物生长 395

（一）细胞生长概述 395

（二）群体生长 396

（三）群体细胞生长周期 397

1．延迟期 397

2．指数生长期 397

3．稳定期 398

4．死亡期 398

二、微生物污染 398

（一）微生物污染的判断 399

（二）微生物污染的观察 399

（三）真菌污染及检测 399

1．常用的真菌培养基 400

2．样品的检查、接种和培养 400

（四）细菌污染及检测 401

1．常用的细菌培养基 401

2．样品的检查、接种和培养 402

（五）支原体污染及检测 402

1．支原体对细胞的影响 403

2．支原体污染的检测 404

（六）病毒污染及检测 409

1．常规检测 409

2．反转录病毒的测定 412

3．牛腹泻病毒的检测 414

三、个体、种间交叉污染的检测 415

（一）细胞交叉污染对细胞的影响 415

（二）细胞交叉污染的判定 415

1．细胞遗传学方法 415

2．免疫学方法 415

3．生化遗传学方法 415

四、原生动物组织污染 416

（一）原生动物污染 416

（二）原生动物污染的检测 416

1．溶液和原生动物培养基的制备 416

2．接种到原生动物培养基上的培养细胞样品的制备 418

3．用于Giemsa染色的培养细胞的制备 418

第三节 污染的预防和消除 419

一、微生物生长的控制 419

（一）加热灭菌 419

（二）辐射灭菌 419

（三）过滤灭菌 421

（四）化学物质对微生物生长的控制 421

（五）生长因子类似物 422

（六）抗生索 422

（七）β-内酰胺类抗生素：青霉素和头孢霉素 423

（八）由原核生物产生的抗生素 424

（九）病毒的控制 425

（十）真菌的控制 426

（十一）抗生素抗性 427

1．R质粒引起的抗性机制 428

2．抗性质粒的来源 428

3．抗生素抗性的传播 429

4．克服抗药性的方法 429

二、污染的预防 430

（一）工作环境的无菌 430

（二）器皿的灭菌 431

（三）无菌技术 431

（四）操作过程中污染的预防 431

1．培养操作前的准备 431

2．培养操作中的注意事项 431

3．其他注意事项 432

三、污染的消除 432

（一）消除方法 432

1．抗生素排除法 432

2．加温除菌 432

3．动物体内接种 433

4．巨噬细胞吞噬法 433

（二）确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤 433

（三）针对某一种微生物污染的消除 433

1．支原体的消除 433

2．病毒污染的消除 434

第十三章 家养动物体外培养细胞的生物学性状检测 435

第一节 总论 435

一、细胞体外培养的常规检查 435

（一）细胞的一般形态 435

（二）细胞增殖生长状态 436

（三）培养液 437

（四）微生物污染 437

二、细胞生物学性状检测 437

（一）形态学观察 437

（二）细胞增殖生长观察 438

（三）其他观察 438

第二节 普通光学显微镜 438

一、光学显微镜的成像原理、构造与性能 438

（一）成像原理 438

（二）构造 438

1．机械部分 439

2．照明部分 439

3．光学部分 440

（三）显微镜的性能 440

1．数值孔径 440

2．分辨力 441

3．放大率 441

4．焦深 442

二、显微镜的使用方法 442

（一）观察前的准备 442

1．显微镜的放置 442

2．调节光照 442

3．调节光轴中心 442

（二）低倍镜观察 442

（三）高倍镜观察 443

（四）油镜观察 443

三、使用显微镜的注意事项 443

第三节 特殊光学显微镜 444

一、暗视野显微镜 444

（一）概述 444

（二）原理 444

（三）操作步骤和注意事项 445

1．操作步骤 445

2．注意事项 445

二、相差显微镜 445

（一）概述 445

（二）原理和结构特点 446

1．原理 446

2．结构特点 446

（三）操作步骤和注意事项 447

1．操作步骤 447

2．注意事项 447

三、荧光显微镜 448

（一）概述 448

（二）原理和结构特点 448

1．原理 448

2．结构特点 449

（三）荧光显微镜的分类 449

1．透射式荧光显微镜 449

2．落射式荧光显微镜 449

（四）操作步骤和注意事项 450

1．操作步骤 450

2．注意事项 450

四、偏振光显微镜 452

（一）概述 452

（二）原理和结构特点 452

1．原理 452

2．结构特点 452

（三）注意事项 453

五、干涉显微镜 453

（一）概述 453

（二）原理和结构特点 453

1．原理 453

2．结构特点 453

六、扫描隧道显微镜 454

（一）概述 454

（二）原理和结构特点 455

1．原理 455

2．结构特点 455

七、原子力显微镜 455

（一）概述 455

（二）原理和结构特点 455

1．原理 455

2．结构特点 456

八、视频显微镜 457

（一）概述 457

（二）原理和结构特点 457

1．原理 457

2．结构特点 457

九、激光共聚焦扫描显微镜 458

（一）概述 458

（二）原理和结构特点 458

1．原理 458

2．结构特点 459

第四节 电子显微镜术观察的一般过程 459

一、透射电子显微镜 460

（一）基本原理 460

（二）制样技术 461

1．超薄切片 461

2．负染技术 461

3．冰冻蚀刻 461

（三）样品制备 462

1．超薄切片法 462

2．冷冻超薄切片法 464

3．冷冻复型法 465

（四）观察方法 465

二、扫描电子显微镜 466

（一）样品制备 467

1．取材与清洗 467

2．固定 467

3．脱水 467

4．干燥 467

5．喷镀 468

（二）观察方法 468

三、超高压电子显微镜 469

四、扫描式透射电子显微镜 469

第五节 细胞的形态学观察 469

一、培养细胞的形态分类 469

（一）成纤维型细胞 469

（二）上皮型细胞 469

（三）游走型细胞 470

二、培养细胞形态观察方法 470

（一）直接观察法 470

1．相差显微镜观察 470

2．细胞生长状态的动态观察 472

（二）固定观察法 472

1．固定方法 473

2．固定剂 473

3．染色 473

三、电子显微镜观察法 474

（一）原理 474

（二）方法 474

1．透射观察法 474

2．扫描观察 475

第六节 细胞化学技术 475

一、细胞的染色方法 476

（一）培养细胞的活体染色方法 476

1．贴壁细胞吉姆萨染色法 476

2．悬浮细胞吉姆萨染色法 476

3．台盼蓝染色法 477

（二）细胞内糖类染色方法——过碘酸席夫反应法 478

1．基本原理 478

2．试剂配制 478

3．染色步骤（以盖片培养法为例） 479

4．结果 479

（三）苏木精-伊红（HE）染色 479

1．染液制备 479

2．染色步骤（以盖片培养法为例） 480

3．结果 480

（四）细胞的脂类染色方法苏丹红Ⅲ染色法 480

1．原理 480

2．配制试剂 480

3．染色步骤 480

4．结果 481

（五）细胞骨架的染色方法 481

1．微丝的显示方法步骤 481

2．微管的显示方法 481

（六）富尔根反应显示DNA 482

1．原理 482

2．配制试剂 482

3．染色步骤 482

4．结果 482

（七）甲基绿-哌咯宁法显示DNA和RNA 482

1．原理 482

2．配制试剂 483

3．染色步骤 483

4．结果 483

（八）DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法 483

1．原理 483

2．材料 483

3．染色步骤 484

4．结果 484

二、细胞内的酶的检测 484

（一）酸性磷酸酶的检测 484

1．原理 484

2．作用液的配制 485

3．染色步骤 485

4．设立对照 485

5．结果 485

（二）葡萄糖-6-磷酸酶的检测 485

1．作用液的配制 486

2．染色程序 486

3．设立对照 486

4．结果 486

（三）琥珀酸脱氢酶的检测 486

1．配制作用液 486

2．组织切片染色程序 486

3．对照方法 487

4．结果 487

第七节 免疫细胞化学技术 487

一、免疫细胞化学技术的概述 487

（一）原理 487

（二）免疫细胞化学技术的特点 487

1．高度特异性 487

2．敏感性高 488

3．方法步骤统一 488

4．形态、机能和代谢密切结合 488

（三）免疫细胞化学的全过程 488

（四）免疫细胞化学技术的研究进展 488

二、细胞标本的制备和固定 489

（一）细胞标本制备 489

（二）细胞标本的固定 489

1．物理固定 489

2．化学固定 489

（三）固定剂 489

1．醛类固定剂 490

2．非醛类固定剂 491

3．丙酮及醇类固定剂 491

（四）选择最佳固定液的标准 492

（五）细胞固定的注意事项 492

三、免疫细胞化学所需抗体的制备和配制 492

（一）抗体的制备 492

（二）抗体的配制 493

1．抗体使用液的配制 493

2．抗体稀释液的配制 494

（三）抗体的储存与孵育 494

1．一抗的储存 494

2．一抗的孵育 494

3．二抗的储存、稀释和孵育 495

四、免疫细胞化学技术常用的标记物 495

（一）辣根过氧化物酶 495

1．底物DAB显色溶液的配制 495

2．显色 495

3．停止反应，用PBS冲洗，室温晾干保存 496

4．注意事项 496

（二）碱性磷酸酶 496

1．快红（或快蓝）法 496

2．新品红法 496

（三）荧光素 497

（四）胶体金与免疫金银技术 497

1．胶体金的制备方法 498

2．制备高质量胶体金的注意事项 498

3．免疫胶体金制备 499

4．免疫胶体金的应用 500

5．免疫金及免疫金银技术的优点 501

五、免疫染色程序 501

（一）免疫细胞化学染色的典型程序 501

1．免疫酶间接法 501

2．免疫荧光LSAB法 502

3．PAP法 502

4．SPA-胶体金银法 503

（二）在各种免疫染色中都必须注意的几个问题 503

1．固定 503

2．细胞表面抗原的免疫染色 503

3．非特异性背景染色 504

4．设立对照 504

5．增强特异性染色的方法 505

6．消除非特异性染色的方法 506

7．显色反应的控制 506

8．复染 506

六、标记方法 506

（一）免疫荧光技术 507

1．直接法 507

2．间接法 507

3．标本保存及封片介质的制备 508

（二）免疫酶细胞化学技术 508

1．直接法 509

2．间接法 509

3．酶-抗酶方法 510

4．双PAP法 510

5．卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法 511

6．标记的链霉卵白素-生物素法（LSAB） 512

7．双染色技术 512

七、免疫细胞化学结果的判断 512

（一）阴性对照、阳性对照和吸收试验 512

（二）特异性染色和非特异性染色的判断 513

（三）阳性细胞的染色特征 513

（四）染色失败的几种原因 514

第八节 免疫荧光细胞化学技术 514

一、免疫荧光细胞化学的原理 515

（一）直接法 515

1．检查抗原法 515

2．检查抗体法 515

（二）间接法 515

1．检查抗体法 515

2．夹心法 516

3．检查抗原法双薄片法 516

（三）补体法 516

1．直接检查组织内免疫复合物法 516

2．间接检查组织内抗原法 516

（四）双重免疫荧光标记法 516

（五）对照试验 517

1．直接法 517

2．间接法 517

3．补体法 517

二、荧光抗体的制备 518

（一）荧光素 518

1．异硫氰酸荧光素 518

2．四乙基罗丹明 518

3．四甲基异硫氰酸罗丹明 520

（二）荧光素标记抗体的方法 520

1．FITC标记抗体的方法 520

2．四乙基罗丹明标记抗体的方法 522

3．四甲基异硫氰酸罗丹明标记抗体的方法 523

4．藻红蛋白标记抗体的方法 523

5．PE-标记蛋白A方法 524

6．蓝色荧光素标记抗体的方法 524

（三）荧光抗体质量控制 524

1．染色特异性和敏感性的测定 524

2．F/P比值的测定 525

（四）荧光抗体的保存 526

三、免疫荧光细胞化学染色方法 526

（一）标本制作 526

（二）荧光抗体染色方法 526

1．直接法 526

2．间接法 527

3．补体法 528

4．膜抗原荧光抗体染色法 528

5．双重染色法 528

6．荧光抗体再染色法 529

（三）荧光抗原染色法 529

第九节 细胞的增殖动力学检测 529

一、活细胞的染料排除检测法 529

（一）台盼蓝排除检测法 529

1．2％台盼蓝溶液的配制 529

2．染色与细胞计数 530

（二）溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法 530

1．EB或PI染液的配制 530

2．荧光染色与计数 530

（三）0.05％苯胺黑排除检测法 530

（四）0.1％结晶紫排除检测法 530

二、细胞计数 530

（一）仪器、用品与试剂 530

1．仪器与用品 530

2．试剂 531

3．材料 531

（二）操作步骤 531

三、细胞活力测定 532

（一）细胞计数测定活力 532

（二）四唑盐比色法测定活力 532

1．试剂和器材 532

2．操作步骤 532

3．注意事项 533

四、细胞的增殖动力学检测 533

（一）细胞生长曲线 533

1．培养细胞 533

2．计数细胞密度 533

3．绘制曲线 533

（二）细胞周期的测定 534

1．原理 534

2．仪器、用品与试剂 534

3．操作步骤 534

（三）细胞分裂指数 535

1．原理 535

2．仪器、用品与试剂 535

3．操作步骤 535

4．注意事项 535

（四）细胞增殖活性测定的3H-TdR掺入法 536

掺入法……536 （五）细胞增殖能力分析试剂盒 537

（六）荧光素发光法细胞生存能力检测试剂盒 537

（七）接种存活率和克隆形成率 537

1．细胞克隆形成率实验 538

2．提高克隆形成率的方法 540

3．细胞克隆技术 541

第十节 流式细胞仪检测 543

一、流式细胞仪的工作原理 543

（一）参数测量原理 543

（二）样品分选原理 544

（三）数据处理原理 545

1．数据显示 545

2．数据分析 545

二、流式细胞仪的基本结构 546

（一）液流系统 546

（二）光学系统 547

（三）电子系统 547

（四）资料存储和计算机控制系统 548

（五）细胞分选系统 549

三、用流式细胞仪检测的单细胞悬液的制备 549

（一）贴壁培养细胞单细胞悬液的制备 549

1．材料 549

2．操作步骤 549

（二）机械法制备新鲜实体组织的单细胞悬液 550

1．材料 550

2．操作步骤 550

（三）石蜡包埋组织的单细胞悬液制备 550

1．材料 550

2．操作步骤 551

四、流式细胞仪标本的制备 551

（一）原理 551

（二）试剂和器材 551

（三）操作步骤 551

（四）注意事项 552

五、流式细胞仪的应用 552

（一）DNA含量及细胞周期分析 553

1．材料 553

2．操作步骤 553

（二）单个细胞细胞周期素的检测 554

1．材料 554

2．操作步骤 554

3．方法评注 555

（三）评估肿瘤细胞对化疗药物的耐药性 555

1．材料 555

2．操作步骤 556

3．方法评注 557

（四）单细胞内细胞因子产物的检测 557

1．材料 557

2．操作步骤 558

3．方法评注 559

4．注意事项 559

（五）FCM在免疫表型分析上的应用 560

（六）FCM用于定量分析 560

（七）FCM用于细胞功能的分析 560

（八）FCM用于细胞凋亡的研究 561

（九）FCM在其他方面的应用 561

第十一节 细胞毒性检测 561

一、细胞毒性的评价指标 561

（一）反映形态学改变的指标 561

（二）反映细胞数量多少的指标 561

（三）反映细胞膜完整性或通透性的指标 561

（四）反映细胞亚细胞器损伤的指标 562

（五）反映细胞代谢活性的指标 562

二、细胞毒性检测方法 562

（一）细胞毒性的形态观察方法 562

1．倒置显微镜下直接观察细胞形态 562

2．吉姆萨染色后观察细胞形态 562

3．HE染色后观察细胞形态 563

（二）细胞的数量检测 564

1．细胞计数法 564

2．四甲基偶氮唑盐微量酶反应显色法 564

3．WST-1试验 565

4．中性红试验 566

5．结晶紫试验 566

6．WST-1、中性红、结晶紫联合检测细胞毒性 567

（三）细胞膜完整性或通透性检测 567

1．台盼蓝拒染试验 567

2．乳酸脱氢酶漏出率 568

3．荧光染色法 569

（四）细胞代谢活性的检测 570

1．细胞中蛋白质含量测定 570

2．细胞蛋白质合成测定 571

3．细胞内还原型谷胱甘肽含量测定 571

4．脂质过氧化产物生成量测定 572

5．测定DNA合成的放射性同位素摄入法 573

三、评价材料生物相容性的细胞毒性试验方法 573

（一）间接法 574

1．琼脂覆盖法 574

2．分子滤过法 574

3．甲基纤维素细胞培养法 574

（二）直接法 574

1．直接浸渍法 575

2．直接接触法 575

四、细胞毒性试验研究进展 575

第十四章 家养动物细胞遗传学性状检测 577

第一节 细胞的遗传学 578

一、染色质与染色体 578

（一）染色质的化学组成 578

1．DNA 578

2．组蛋白 579

3．非组蛋白 579

4．RNA 580

（二）染色质的类型 580

（三）染色质的基本结构单位 580

（四）染色质的高级结构 581

1．核小体 581

2．螺线管 581

3．超螺线管 581

4．染色单体 581

（五）染色体的形态与结构 581

1．染色单体 582

2．主缢痕 582

3．着丝粒 582

4．染色体臂 583

5．次缢痕 583

6．随体 583

7．端粒 583

二、细胞分裂过程中的染色体行为 584

（一）有丝分裂 584

（二）减数分裂 584

1．减数分裂Ⅰ 585

2．减数分裂Ⅱ 585

三、染色体畸变 585

（一）染色体异常 585

（二）染色体畸变的原因 586

第二节 性染色质检测 586

一、原理 586

二、方法 587

（一）染色法显示X染色质 587

1．碳酸复红法 587

2．染色步骤 587

3．结果 587

（二）荧光染色显示Y染色质法 587

1．荧光染液 587

2．染色 587

3．结果 588

第三节 培养细胞染色体显示法 588

一、制备染色体的原理 588

（一）提高细胞分裂相数量 588

1．刺激细胞增殖 588

2．阻抑中期分裂相 588

（二）促染色体分散措施 589

1．低渗处理 589

2．醋酸／甲醇固定 589

二、外周血淋巴细胞染色体标本制备 589

（一）用品与试剂 589

（二）操作步骤 589

1．培养液准备 589

2．血细胞培养 590

（三）注意事项 590

三、羊水细胞培养 591

（一）用品与试剂 591

（二）操作步骤 591

1．抽取羊水 591

2．离心分离 591

3．培养 591

4．终止培养 592

5．低渗、预固定、固定、制片、染色、观察、分析方法同外周血细胞染色体标本制备 592

四、培养细胞染色体标本制备 592

（一）用品与试剂 592

（二）操作步骤 592

1．加秋水仙素 592

2．采集分裂细胞和离心 592

3．低渗处理 592

4．预固定 592

5．固定 592

6．制片 593

（三）分析 593

五、核型分析 594

（一）仪器与材料 594

（二）操作步骤 595

第四节 染色体结构显示和检测 596

一、染色体显带 596

（一）染色体显带技术 596

1．基于染料的染色体显带技术 597

2．基于功能的显带技术 599

3．染色体显带与荧光原位杂交技术 599

4．减数分裂染色粒带型 599

5．核酸酶显带技术 600

6．抗体显带技术 600

7．DNA杂交显带技术 600

8．G11显带技术 601

（二）常用染色体显带方法 601

1．显C带法 601

2．显Q带法 602

3．显G带法 603

4．显N带法 604

二、姐妹染色单体区分染色法 605

（一）原理 605

（二）用品和试剂 606

（三）操作步骤 606

三、染色体脆性位点的检测 606

四、微核检测 607

（一）原理 607

1．人末梢血淋巴细胞培养 607

2．二倍体细胞 607

3．动物骨髓细胞 607

4．动物肝细胞 608

5．人口腔上皮细胞 608

6．植物细胞 608

（二）用品和试剂 608

（三）操作步骤 608

1．细胞培养 608

2．制片 608

3．染色 608

4．镜检及统计分析 608

（四）注意事项 609

五、非程序DNA合成检测 609

（一）原理 609

（二）用品和试剂 610

1．培养的原代肝细胞，恒温水浴箱、冰箱、生物显微镜 610

2．试剂 610

（三）操作步骤 610

1．细胞准备 610

2．染毒与标记 610

3．放射自显影处理 611

4．细胞染色 611

5．结果观察 611

（四）结果与分析 611

（五）注意事项 612

第五节 细胞DNA遗传特征分析 612

一、细胞DNA含量测定 612

（一）用品和试剂 612

（二）操作步骤 613

二、细胞DNA合成测定 613

（一）用品和试剂 613

（二）操作步骤 613

（三）注意事项 614

第六节 染色体基因定位 614

一、基因定位的方法 615

（一）体细胞杂交法 615

（二）原位杂交技术 615

（三）连锁分析 616

二、荧光标记原位杂交法 616

（一）原理 617

（二）材料 618

（三）探针的制备、标记和鉴定 618

1．质粒DNA的扩增、提取及纯化 618

2．探针的标记 618

3．探针的纯化 618

4．探针的鉴定 618

（四）荧光原位杂交 619

1．杂交实验材料预处理 619

2．杂交 619

（五）检测 619

1．杂交后洗涤 619

2．直接标记荧