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第1章 细胞培养基本知识 1

1.1 前言 1

1.2 细胞培养简史、现状及发展趋势 1

1.3 细胞培养的优点和缺点 3

1.3.1 细胞培养的优点 3

1.3.2 细胞培养的缺点 3

1.4 细胞培养的应用范围和领域 4

1.4.1 细胞培养的应用范围 4

1.4.2 细胞培养的应用 4

1.5 培养细胞的特性 5

1.5.1 培养细胞的生长方式及类型 5

1.5.2 培养细胞的增殖特点 6

1.5.3 培养细胞的生长过程 8

1.6 培养细胞生长的条件 15

1.6.1 细胞的营养需要 15

1.6.2 细胞的生存环境 18

1.6.3 无污染及无毒 19

第2章 细胞培养室的设置、设备和准备工作 20

2.1 细胞培养实验室的设置及设备 20

2.1.1 细胞培养实验室的设置 20

2.1.2 细胞培养实验室的设备 21

2.2 培养用品的清洗和消毒灭菌 27

2.2.1 培养用品的清洗 27

2.2.2 培养用品的消毒灭菌 29

第3章 细胞培养用液及培养基（液） 33

3.1 培养用液 33

3.1.1 水 33

3.1.2 平衡盐溶液 33

3.1.3 消化液 35

3.2 培养基（液） 39

3.2.1 天然培养基 39

3.2.2 合成培养基（液） 41

第4章 细胞培养技术 51

4.1 基本操作技术和要求 51

4.1.1 细胞培养室内的无菌操作 51

4.1.2 培养细胞的取材 52

4.1.3 组织材料的分离 54

4.2 原代培养 57

4.2.1 组织块培养法 58

4.2.2 消化培养法 59

4.2.3 器官培养 59

4.3 传代培养和细胞系的维持 62

4.3.1 原代培养的首次传代 62

4.3.2 细胞传代方法 62

4.3.3 细胞系的维持 63

4.3.4 培养细胞的纯化 64

4.4 培养细胞生长状况的观察 66

4.4.1 培养细胞的常规观察 66

4.4.2 活细胞的观察 67

4.4.3 细胞生长状况的观察 69

4.5 细胞冻存与复苏 73

4.5.1 细胞的冻存 73

4.5.2 细胞的复苏 75

4.5.3 培养细胞的运输 75

4.6 细胞培养污染的检测和排除 76

4.6.1 微生物污染的途径 76

4.6.2 微生物污染对细胞的影响 76

4.6.3 微生物污染的检测 77

4.6.4 微生物污染的防治 79

4.6.5 细胞交叉污染 79

4.7 细胞系特征及细胞系间交叉污染的测定 80

4.7.1 同工酶 80

4.7.2 血型及主要组织相容性抗原的测定 80

4.7.3 G显带技术 81

4.7.4 DNA指纹分析 81

4.8 细胞系组织来源的鉴定 81

4.8.1 具有特征性标志的超微结构分析 81

4.8.2 免疫学试验测定细胞骨架蛋白 82

4.8.3 组织特异性抗原的鉴定 82

4.8.4 细胞特殊功能的生化检查方法 82

4.8.5 细胞来源及特征数据的计算机化 83

4.9 微囊化细胞培养 83

4.9.1 概述 83

4.9.2 细胞微胶囊的制备材料 85

4.9.3 细胞微胶囊的制备方法 85

4.10 三维细胞培养技术 89

4.10.1 三维培养技术的概述 89

4.10.2 三维细胞培养技术的发展历史 89

4.10.3 三维细胞培养技术的分类 90

4.10.4 三维细胞培养中涉及的生物支架材料 92

4.10.5 生物反应器在三维培养中的作用 92

4.10.6 微载体系统在三维培养中的应用 93

4.11 细胞打印技术 94

4.11.1 细胞打印技术的分类 94

4.11.2 细胞打印技术的应用 95

第5章 正常组织细胞的培养 97

5.1 上皮细胞 97

5.1.1 表皮细胞 97

5.1.2 乳腺上皮细胞 100

5.1.3 子宫颈上皮细胞 101

5.1.4 口腔黏膜上皮细胞 103

5.1.5 胆管和胆囊上皮细胞 105

5.1.6 前列腺上皮细胞 106

5.1.7 肝细胞 107

5.1.8 胰腺细胞 110

5.1.9 肾上皮细胞 111

5.1.10 气管和肺泡上皮细胞 112

5.1.11 唾液腺上皮细胞 114

5.2 内皮细胞 115

5.3 神经外胚层细胞 116

5.3.1 神经元细胞 116

5.3.2 神经胶质细胞 117

5.3.3 黑色素细胞 118

5.4 中胚层细胞 119

5.4.1 结缔组织细胞 119

5.4.2 脂肪组织细胞 119

5.4.3 肌肉组织细胞 120

5.4.4 软骨细胞 121

5.4.5 骨细胞 122

5.4.6 成骨细胞 122

5.4.7 破骨细胞 125

5.4.8 巨噬细胞 127

5.4.9 牙周膜细胞 128

5.4.10 牙髓细胞 128

5.5 血细胞 129

5.5.1 前体血细胞骨髓培养法 129

5.5.2 脐血细胞培养 130

5.5.3 淋巴细胞培养 131

5.6 干细胞 132

5.6.1 胚胎干细胞 133

5.6.2 诱导性多能干细胞 142

5.6.3 造血干细胞 144

5.6.4 神经干细胞 146

5.6.5 骨髓间充质干细胞 147

5.6.6 脂肪源性干细胞 149

5.6.7 牙髓干细胞 150

第6章 肿瘤细胞培养及实验方法 152

6.1 肿瘤细胞的取材及培养 152

6.1.1 肿瘤细胞的取材方法 152

6.1.2 肿瘤细胞的培养方法 153

6.2 培养肿瘤细胞的生物学鉴定 154

6.2.1 培养肿瘤细胞常用的生物学检查项目 154

6.2.2 人的恶性肿瘤连续性细胞系（株）的建系（株）标准 154

6.3 抗癌药物敏感性试验 156

6.3.1 试验药物储备液的配制 156

6.3.2 受试细胞的准备 157

6.3.3 药物疗效的评价 157

6.3.4 药物敏感性试验 157

6.4 裸鼠移植瘤模型 161

6.4.1 概述 161

6.4.2 制备裸鼠移植瘤动物模型的基本方法 162

6.5 肿瘤放射生物学实验 163

6.5.1 肿瘤放射生物学培养细胞实验 163

6.5.2 肿瘤放射生物学的实体瘤整体水平实验 167

6.6 肿瘤细胞体外黏附实验 168

6.6.1 肿瘤细胞在细胞外基质上黏附的测定 168

6.6.2 肿瘤细胞与内皮细胞黏附的测定 169

6.7 肿瘤细胞迁移实验 170

6.7.1 细胞划痕法 170

6.7.2 Millicell 小室测定法 171

6.8 肿瘤侵袭实验 171

6.8.1 体内癌细胞侵袭实验 171

6.8.2 体外癌细胞侵袭实验 173

6.9 肿瘤转移实验 176

6.10 肿瘤细胞分化诱导模型 177

6.10.1 体外分化诱导实验 177

6.10.2 体内分化诱导实验 179

6.11 肿瘤干细胞 179

6.11.1 肿瘤干细胞的特性 180

6.11.2 肿瘤干细胞的分离培养 180

6.12 纳秒脉冲电场治疗肿瘤实验 182

第7章 细胞培养中的研究方法 184

7.1 细胞活力的检测方法 184

7.1.1 染料排除法 184

7.1.2 克隆（集落）形成试验 185

7.1.3 MTT比色试验 187

7.1.4 XTT比色试验 189

7.1.5 三磷酸腺苷发光试验 190

7.1.6 细胞蛋白质含量测定法 191

7.1.7 细胞蛋白质合成测定法 192

7.2 细胞遗传学的检测方法 192

7.2.1 细胞DNA染色法 192

7.2.2 细胞DNA含量测定法 193

7.2.3 细胞DNA合成测定法 194

7.2.4 常用染色体显示法 195

7.2.5 染色体显带法 196

7.3 细胞形态学的研究方法 197

7.3.1 培养细胞的HE染色方法 197

7.3.2 培养细胞的免疫细胞化学染色技术 198

7.3.3 培养细胞嗜银蛋白（AgNORs）分析 201

7.3.4 培养细胞的化学染色 202

7.4 细胞凋亡的检测方法 203

7.4.1 形态学方法 203

7.4.2 电泳法 205

7.4.3 原位缺口末端标记法 205

7.4.4 流式细胞术测定法 206

7.4.5 免疫学方法 207

7.5 端粒酶活性的检测方法 208

7.5.1 端粒重复序列扩增-银染法 208

7.5.2 TRAP-ELISA法 210

7.6 明胶酶活性的测定方法 211

7.7 细胞同步化 213

7.7.1 M期同步化方法（振荡收集法） 213

7.7.2 S期同步化方法（胸腺嘧啶核苷双阻断法） 214

第8章 有关的部分实验技术 217

8.1 细胞分离技术 217

8.1.1 速度沉降分离法 217

8.1.2 等密度沉降分离法 218

8.1.3 流式细胞仪分离法 221

8.1.4 免疫磁珠分离法 221

8.2 细胞器分离技术 223

8.2.1 破碎细胞的方法 223

8.2.2 部分细胞器的分离法 224

8.3 细胞克隆技术 230

8.3.1 有限稀释法 231

8.3.2 平皿克隆分离法 231

8.3.3 软琼脂克隆分离法 232

8.3.4 单细胞显微操作法 232

8.4 杂交瘤技术 233

8.4.1 杂交瘤技术的基本原理 233

8.4.2 杂交瘤技术的主要用品 235

8.4.3 骨髓瘤（浆细胞瘤）突变缺陷细胞株的选择与传代培养 236

8.4.4 免疫脾细胞的制备 236

8.4.5 饲养细胞的制备 237

8.4.6 细胞融合 237

8.4.7 单克隆抗体的检测 238

8.4.8 克隆化培养 238

8.4.9 单克隆抗体的大量制备 239

8.4.10 杂交瘤细胞染色体的鉴定 239

8.4.11 单克隆抗体的鉴定 239

第9章 相关的部分分子生物学技术 240

9.1 培养细胞基因组DNA的提取及分析 240

9.1.1 培养细胞基因组DNA的提取 240

9.1.2 DNA鉴定 241

9.1.3 Southern blot 242

9.2 培养细胞总RNA的提取及分析 245

9.2.1 培养细胞总RNA的提取 245

9.2.2 RNA鉴定 246

9.2.3 Northern blot 247

9.2.4 RT-PCR 248

9.3 培养细胞的原位杂交 249

9.4 探针标记 250

9.4.1 DNA缺口翻译标记 250

9.4.2 末端标记 251

9.4.3 随机引物DNA标记 252

9.4.4 RNA探针标记 252

9.4.5 地高辛标记RNA 253

9.5 Western blot 253

9.6 基因转染 256

9.6.1 磷酸钙共沉淀法 256

9.6.2 脂质体转染法 257

9.6.3 反转录病毒DNA转染法 258

第10章 培养细胞检测有关的分析仪器 260

10.1 流式细胞仪 260

10.1.1 概述 260

10.1.2 结构原理 260

10.1.3 细胞样品准备 261

10.1.4 仪器操作步骤 263

10.1.5 操作和使用中的注意事项 263

10.1.6 FCM应用范围 263

10.2 激光扫描共聚焦显微镜 264

10.2.1 概述 264

10.2.2 结构原理 264

10.2.3 样品准备 264

10.2.4 仪器操作步骤 264

10.2.5 CLSM应用范围 265

10.3 扫描电子显微镜 266

10.3.1 概述 266

10.3.2 结构原理 266

10.3.3 培养细胞的样品制备 266

10.3.4 仪器操作步骤 267

10.3.5 仪器操作注意事项 268

10.3.6 SEM应用范围 268

10.4 透射电子显微镜 268

10.4.1 概述 268

10.4.2 结构原理 268

10.4.3 培养细胞的样品准备 268

10.4.4 仪器操作步骤 270

10.4.5 TEM应用范围 271

10.5 原子力显微镜 271

10.5.1 概述 271

10.5.2 结构原理 271

10.5.3 样品准备 271

10.5.4 仪器操作步骤 271

10.5.5 AFM应用范围 272

10.6 活细胞工作站 273

10.6.1 概述 273

10.6.2 结构原理 273

10.6.3 仪器操作步骤 274

10.6.4 LCIS应用范围 274

附录Ⅰ 细胞系或株的查询网址 275

附录Ⅱ 细胞培养常用名词解释 276

附录Ⅲ 细胞培养中常用术语的译名 286

附录Ⅳ 细胞培养常用的溶液 296

附录Ⅴ 离心速度和离心力的换算 300

参考文献 301