基因操作技术PDF电子书下载

第一章 常用蛋白质实验技术 1

一、硫酸铵分级沈淀 1

二、相分配法除核酸 2

（一）试剂和贮备溶液 3

（二）从大量蛋白质中除去核酸 3

（三）从核蛋白中提纯蛋白质 4

三、离子交换层析 5

（一）离子交换树脂的处理 5

（二）离子交换层析操作 5

四、蛋白质浓度测定 8

（一）光吸收法 8

（二）双缩脲法 8

（三）劳瑞（Lowry）法 9

（四）劳瑞微量法 9

五、蛋白质溶液的浓缩 10

六、稳定蛋白质的方法 11

七、聚丙烯醯胺凝胶电泳 12

（一）凝胶夹层的组装 12

（二）带浓缩胶的SDS-凝胶电泳 14

（三）尿素-SDS-梯度凝胶电泳 16

（四）凝胶染色 18

（五）萤光显影 18

第二章 常用核酸实验技术 20

一、核酸浓度及纯度测定 20

（一）分光光度法 20

（二）溴乙锭萤光法 20

二、核酸的制备 22

（一）大肠杆菌DNA的制备 22

（二）果蝇DNA的制备 23

（三）果蝇全RNA的制备 25

（四）果蝇rRNA的制备 26

三、DNA的纯化 27

（一）DEAE-纤维素层析 28

（二）HAP吸附层析 29

四、Sephadex G-50凝胶过滤 29

（一）Sephadex G-50处理 30

（二）常规柱层析法 30

（三）旋转柱层析法 30

五、DNA凝胶电泳 31

（一）琼脂糖凝胶电泳 32

（二）聚丙烯醯胺凝胶电泳 35

（三）凝胶染色与摄影 36

（四）从凝胶中洗脱DNA 37

六、核酸浓缩 38

（一）乙醇沈淀 38

（二）丁醇抽提 39

七、核酸沈淀 40

（一）乙醇沈淀 40

（二）三氯乙酸沈淀 40

（三）聚乙二醇沈淀 41

八、DNA的贮存 42

九、三磷酸核苷溶液的配制 42

十、核苷酸纸层析 43

第三章 载体—宿主体系 44

一、质粒 44

（一）质粒载体举例 44

（二）外源DNA克隆 53

二、λ噬菌体 58

（一）溶菌生长途径 59

（二）溶源生长途径 60

（三）λ载体的构建 61

（四）载体选择 61

（五）λ载体图谱 62

三、科斯体 81

四、单股DNA噬菌体 85

（一）划线法 89

第四章 细菌和噬菌体繁殖与贮存 89

一、单菌落分离 89

（二）稀释法 90

（三）涂布法 90

二、细菌的培养与贮存 91

（一）细菌培养 91

（二）细菌贮存 91

三、λ噬菌体的纯化与增殖 92

（一）宿主菌培养 92

（二）噬菌斑形成 92

（三）噬菌斑选取 93

（四）噬菌体制备 93

四、培养基与抗生素 95

（一）液体培养基 95

（二）固体培养基 97

（三）抗生素 97

（一）感染法 99

第五章 载体DNA的制备 99

一、λ噬菌体的大量制备 99

（二）诱导法 100

（三）λ噬菌体的纯化 101

（四）λDNA的提纯 104

二、质粒DNA的大量制备 105

（一）细菌培养与质粒扩增 105

（二）菌体收集与溶菌 106

（三）闭环DNA的提纯 108

（四）RNA的除去 109

第六章 用於基因操作的酶 110

一、限制性内切核酸酶 110

二、甲基化酶 116

（一）dam甲基化酶 116

（二）dcm甲基化酶 117

（三）EcoRI甲基化酶（大肠杆菌）简介 118

三、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 119

（一）DNA缺口转移反应 119

（二）DNA聚合酶Ⅰ（大肠杆菌）简介 121

四、Klenow聚合酶 123

（一）双链DNA3′-凹端的修补 123

（二）DNA末端的快速标记 124

（三）Klenow酶（大肠杆菌）简介 126

五、T4DNA聚合酶 127

（一）DNA末端的快速标记 127

（二）置换合成 128

（三）T4DNA聚合酶（T4感染的大肠杆菌）简介 130

六、T4多核苷酸激酶 131

（一）DNA5′-突端的标记 131

（二）DNA平端或5′-凹端的标记 132

（三）合成接头的标记 133

（四）DNA5′-突端的标记（交换反应） 134

（五）T4多核苷酸激酶（T4感染的大肠杆菌）简介 135

七、以RNA为模板的DNA聚合酶 136

（一）脱氧寡核苷酸引物的制备 137

（二）杂交探针的制备 138

（三）以RNA为模板的DNA聚合酶（反转录酶）简介 139

八、碱性磷酸酯酶 140

（一）DNA5′-末端磷酸的去除 141

（二）碱性磷酸酯酶（BAP和CIP）简介 142

九、核酸酶Bal31 142

（一）DNA限制位点作图 143

（二）DNA片段克隆 143

（三）核酸酶Bal31 144

十、核酸酶S1 145

十一、绿豆核酸酶 145

十二、核糖核酸酶 146

十三、脱氧核糖核酸酶Ⅰ 146

十五、外切核酸酶Ⅲ 147

十四、外切核酸酶Ⅶ 147

十六、λ外切核酸酶 149

十七、多聚（A）聚合酶 149

十八、T4DNA连接酶 150

十九、末端脱氧核苷酸转移酶 151

二十、T4RNA连接酶 151

第七章 真核mRNA的制备与分析 152

一、细胞质RNA的制备 153

二、Poly(A)+RNA的纯化 155

三、细胞全RNA的制备 156

（一）胍-热酚法 156

（二）胍-氯化铯法 157

四、RNA凝胶电泳分析 158

（一）乙二醛-二甲亚砜系统 158

（二）甲醛系统 159

（三）氢氧化甲汞系统 161

五、RNA的SI酶定位法 162

第八章 cDNA的合成与克隆 165

一、合成cDNA的技术要点 165

（一）cDNA第一链的合成 165

（二）cDNA第二链的合成 166

（三）发夹环的切割 166

二、克隆双链cDNA的方法 167

（一）用匀聚物接尾 168

（二）用合成接头接尾 169

（三）克隆mRNA·cDNA 170

（四）用寡核苷酸引发cDNA第二链的合成 171

（五）用质粒引发cDNA两条链的合成 171

三、克隆cDNA的谋略 172

（一）丰富mRNA的运用 172

（二）稀有mRNA的运用 173

（三）按分子长度富集mRNA 174

（四）合成寡聚脱氧核苷酸的运用 174

（六）免疫沉淀法的运用 175

（五）“对比杂交”的运用 175

四、合成和克隆cDNA的操作 176

（一）匀聚物接尾法 176

（二）双接头法 184

第九章 重组DNA导入宿主菌 188

一、用质粒DNA转化大肠杆菌 188

（一）用氯化钙提高转化率 188

（二）用氯化钙和氯化铷提高转化率 189

（三）用多种塩提高转化率 190

二、λ噬菌体DNA的体外包装 192

（一）λ噬菌体溶源的贮存与检验 193

（二）包装方法Ⅰ 194

（三）包装方法Ⅱ 196

第十章 基因文库的组建 199

一、用λ载体组建文库 199

（一）载体DNA的制备 201

（二）真核DNA片段的制备 204

（三）连接与包装 208

（四）文库扩增 212

二、用科斯体组建基因文库 213

（一）用去末端磷酸的科斯体克隆 213

（二）用去磷黏端不同的科斯体克隆 217

（三）科斯体文库的筛选、扩增与贮存 220

第十一章 重组克隆体鉴别 222

一、原位杂交 222

（一）菌落杂交筛选 223

（二）λ噬菌斑杂交筛选 226

（三）核酸分子杂交 228

二、cDNA克隆体的杂交鉴别 231

（一）膜上杂交法 231

（二）溶胞物转译法 237

（三）蛙卵母细胞转译法 240

（一）原理 242

三、DNA序列的重组鉴别 242

（二）实验材料 245

（三）W3110r？m+（p3）的转化 246

（四）噬菌体校正基因的遗传学检验 246

（五）用λ文库感染W3110r？m+(p3)(πVX) 246

（六）πVX系统的检验 247

（七）πVX系统的使用 249

第十二章 重组克隆体分析 250

一、克隆体DNA的快速分离 250

（一）少量质粒DNA的快速分离 250

（二）少量λ噬菌体DNA的快速分离 253

二、限制酶切点定位 254

（一）依次消化法 255

（二）部分消化法 256

三、DNA序列定位 258

（一）SOUTHERN转移 259

（二）膜上杂交 260

四、DNA片段次级克隆 262

（一）黏端DNA片段次级克隆 262

（二）合成接头的安装 263

（三）补齐5′-突端 263

（四）切除3′-突端 264

（五）合成接头或衔接物安装 265

（六）限制位点的恢复和组建 266

（七）快速克隆 268

第十三章 克隆基因的表达载体 269

一、启动子 269

（一）λ噬菌体PL启动子 270

（二）其它启动子 272

二、核糖体结合位点 272

三、真核基因的表达型载体 273

（一）表达非融合蛋白质的载体 273

（二）表达融合蛋白质的载体 280

四、基因表达的放大 286

五、基因量的扩增 287

六、总结 287

附录Ⅰ 常用生物化学技术 289

玻璃和塑料器皿的处理 289

器皿表面的硅化处理 289

有机试剂处理 289

液体培养基 290

凝胶培养基 291

浓缩培养基 291

λ噬菌体用培养基 291

抗生素溶液 292

贮备溶液 292

常用溶液 293

酶液配制 294

限制酶消化用缓冲液 295

常用凝胶电泳加样缓冲液 296

常用电泳缓冲液 296

32P-标记核苷酸处理 297

基因操作中的核酸纯化 297

放射自显影 298

核酸放射性的定量 299

质粒聚合物的制备 300

Maxam-Gilbert序列测定法 300

商品酸碱浓度和密度 303

附录Ⅱ 常用数据 303

限制酶消化反应条件 307

pBR322DNA限制片段长度（bp） 307

λ噬菌体DNA限制片段长度（bp） 308

RNA凝胶电泳分子量标记物 309

三磷酸核苷和脱氧核苷物化常数 310

蛋白水解酶使用和贮存条件 310

附录Ⅲ 常用菌株 311

参考文献 313