体外培养的原理与技术PDF电子书下载

绪论 1

一、体外培养的概念 1

二、体外培养技术的发展历史 2

(一)体外培养技术的创立 2

(二)体外培养技术的发展 3

(三)我国体外培养工作的发展情况 7

三、体外培养技术的主要类别 8

四、体外培养技术的应用 8

(一)在组织学与胚胎学以及细胞生物学领域的应用 8

(二)在肿瘤学方面的应用 10

(三)在微生物学领域的应用 11

(四)在免疫学方面的应用 12

(五)在药理学领域的应用 12

(六)动物细胞与微生物大规模培养技术在生产实践上的应用 15

(七)在现代医学领域的应用 16

(八)植物组织细胞培养技术的应用 17

五、对体外培养技术的评价 18

第一部 分体外培养的基本原理与技术 21

第一章 从体内生存环境到体外生长条件 21

第一节 体内细胞生存的营养条件 21

一、水 22

二、无机盐类 22

三、葡萄糖 24

四、维生素 25

五、氨基酸 26

第二节 体内细胞生存的其它条件 27

一、温度 27

二、氧和酸碱度 28

三、体液渗透压 29

四、细胞之间的相互联系 29

第三节 体外生长大环境 33

一、体外培养实验室 33

二、体外培养的设备和器具 35

(一)大型设备和仪器 35

(二)培养器具 42

第四节 培养用液 50

一、水与平衡盐溶液 51

(一)水与缓冲液 51

(二)生理盐水与平衡盐溶液 52

二、培养液 54

(一)天然培养基 54

(二)合成培养基 57

(三)无血清培养基 64

三、体外培养的其它常用液 68

(一)其它常用液的类型 68

(二)其它常用液的配制 70

第五节 细胞在体外生长的其它条件 71

一、无污染的气、液相环境 71

二、温度 72

三、生长基质 73

第六节 清洗和消毒 75

一、培养用具的清洗 76

(一)玻璃器皿的清洗 76

(二)胶塞和塑料用品的清洗 77

(三)清洗后物品的包装 77

二、培养用品的消毒和灭菌 78

(一)物理方法 78

(二)化学方法消毒 82

第二章 体外培养的基本方法和过程 87

第一节原代培养 87

一、原代培养的过程 88

(一)取材及培养材料的制备 88

(二)分离(散)细胞的方法 92

(三)接种与培养过程 96

(四)更换培养液 101

二、原代细胞培养方法的注意事项 101

第二节 继代培养 103

一、原代培养物需要传代的指标 103

二、传代的过程 104

三、传代培养的注意事项 106

第三节 体外培养的基本方法和技术 106

一、悬滴培养法 107

(一)Maximow双盖片悬滴培养法 110

(二)改良的植块悬滴培养法 112

二、培养瓶培养法 112

三、盖玻片培养法 115

四、旋转管培养法 115

五、灌注小室培养法 117

六、培养板培养法 120

七、二倍体细胞培养法 121

八、克隆培养法 122

九、中空纤维细胞培养技术 123

十、微载体细胞培养法 126

十一、微囊培养技术 127

第四节 培养物的冻存与复苏 128

一、培养物的冷冻保存与复苏原理 129

(一)冷冻速率 129

(二)冷冻保存温度 130

(三)复温速率 131

(四)冷冻保护剂 131

二、冷冻保存方法 132

(一)非玻璃化冻存方法 132

(二)玻璃化冻存方法 133

三、冻存细胞的复苏 134

(一)非玻璃化冻存细胞的复苏方法 134

(二)玻璃化冻存细胞的复苏方法 135

第五节 培养物的污染 136

一、微生物污染的判断 136

(一)细菌的污染及其判断 136

(二)真菌的污染及其判断 137

(三)支原体的污染及其判断 138

(四)病毒的污染及其判断 140

二、污染的预防 141

三、污染的排除 141

第三章 体外培养物的生长生物学 147

第一节 体外细胞培养物的生长类型 147

一、黏附型细胞 147

(一)上皮型细胞 148

(二)成纤维细胞型细胞 148

(三)游走型细胞 149

(四)多形型细胞 149

二、悬浮型细胞 150

第二节 体外培养物的细胞生物学特点 150

一、培养细胞分化状态的变化 150

二、培养细胞的增殖能力 151

三、体外培养细胞的生长过程 152

(一)原代培养期 152

(二)传代培养期 155

(三)衰退期 157

四、体外培养细胞的形态学 158

五、植块培养物的生长生物学 158

第三节 影响动物细胞体外生长的因素 159

一、营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响 159

(一)血清的成分与作用 159

(二)无血清培养液的设计及应用 161

(三)生长基质成分 168

二、温度条件对细胞生长的影响 169

三、气相环境对细胞生长的影响 170

四、培养液的酸碱度对细胞生长的影响 171

五、辐射线对细胞生长的影响 172

六、超声波对细胞生长的影响 173

七、影响细胞生长的其它因素 173

第四章 细胞分离与纯化 176

第一节 解离(散)组织制备细胞悬液过程中的细胞分离 177

第二节 利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法 179

一、一步密度梯度离心法 181

(一)血细胞的分离 181

(二)玫瑰花环细胞的分离 183

二、等密度梯度离心法 184

(一)连续BSA密度梯度离心法 185

(二)非连续BSA密度梯度离心法 186

(三)连续Percoll密度梯度离心法 187

(四)非连续Percoll密度梯度离心法 188

三、速度沉降法 190

(一)低速离心速度沉降法 190

(二)简单策略沉降法 192

(三)简单重力沉降法分离白细胞与红细胞 192

(四)简单重力沉降法分离粒细胞 193

四、离心淘析分离技术 194

第三节 根据细胞表面电荷的细胞分离方法 195

一、自由流动电泳分离技术 195

二、密度梯度电泳分离技术 197

第四节 基于不同黏附特性的细胞分离方法 197

一、差速黏附处理 197

二、葡聚糖凝胶G-10过柱法 198

三、羰基铁粉法 200

四、尼龙毛分离法 201

第五节 利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法 202

一、免疫溶解法 203

二、盘化法 205

(一)直接法 206

(二)间接法 207

三、凝集素凝集法 209

(一)花生凝集素凝集法分离皮、髓质胸腺细胞 209

(二)大豆凝集素凝集法分离T、B淋巴细胞 210

四、玫瑰花环分离法 211

(一)E玫瑰花环分离法 212

(二)EA玫瑰花环分离法 213

(三)EAC玫瑰花环分离法 214

五、流式细胞分选术 216

(一)流式细胞仪的结构和工作原理 217

(二)流式细胞术分选细胞 219

六、免疫磁珠分离技术 222

第六节 利用其它细胞学特性分离纯化细胞的方法 226

一、反复植块法 226

二、有丝分裂抑制剂处理 226

第五章 细胞系(株)、细胞克隆与细胞周期同步化 229

第一节 细胞系(株)的建立与鉴定 229

一、基本概念 229

二、建立细胞系(株)的档案 230

三、细胞系的鉴定 230

(一)细胞系鉴定的内容 231

(二)细胞系形态学的鉴定方法 231

(三)细胞系的染色体数目、核型及其带谱分析 233

(四)细胞系的同工酶酶谱检测 236

四、细胞系(株)的保藏 240

五、国内部分已建立的细胞系或株名录 241

六、国内部分已建立的单克隆抗体杂交瘤系或株名录 243

七、国外部分已建立的细胞系或株名录 245

第二节 细胞克隆 250

一、克隆培养技术 251

(一)稀释铺板法 251

(二)饲养层克隆法 252

(三)胶原膜板或血纤维蛋白膜层板克隆法 253

(四)琼脂克隆法 253

(五)在琼脂基底上用甲基纤维素克隆化 254

二、影响克隆形成率的因素 254

三、克隆的分离 256

第三节 细胞周期与细胞同步化 257

一、细胞周期 257

二、细胞同步化 261

(一)各期细胞的分离 261

(二)细胞分裂相同步化法 263

第六章 器官培养 267

第一节 器官培养技术概论 267

一、器官培养技术的基本要点 267

二、器官培养技术的发展简史 269

三、器官培养的基本原则 271

(一)养分的供应与取材 271

(二)抑制细胞迁移 272

四、对器官培养技术的评价 272

五、培养器官的生存环境及影响因素 273

(一)培养器官的生存条件及其影响 273

(二)培养器官的内在因素及其影响 275

第二节 器官培养的基本方法 276

一、表玻璃器官培养法 276

二、琼脂凝胶培养法(Wolff器官培养法) 278

三、悬浮培养法 279

四、直接漂浮培养法 279

五、擦镜纸培养法 280

六、金属格栅器官培养法 281

七、琼脂小岛器官培养法 283

八、陈氏滤纸虹吸器官培养法 284

九、灌注式器官培养法 285

十、旋转管培养法 287

十一、摇摆式器官培养法 288

十二、器官灌注系统 289

十三、鸡胚尿囊绒膜培养法 289

十四、早期鸡胚胚盘培养法 291

第三节 器官培养各论 292

一、胚胎肢芽的器官培养 292

(一)胚胎肢芽的血浆凝块器官培养方法 292

(二)胚胎肢芽的琼脂凝胶培养法 294

二、胚胎性腺的器官培养 295

三、软骨与骨的器官培养 296

(一)软骨的器官培养 296

(二)骨的器官培养 297

四、神经组织的器官培养 298

五、牙胚的器官培养 299

(一)Trowell培养法培养牙胚器官 300

(二)悬浮培养法培养牙胚器官 300

六、腭板的器官培养 302

(一)腭板器官的静式培养法 302

(二)腭板器官的转动培养法 303

七、毛囊的器官培养 304

八、血管的器官培养 305

(一)血管的悬浮孵育法器官培养 305

(二)血管的琼脂孔器官培养法 306

九、肝脏的器官培养 307

十、小梁网的器官培养 308

十一、人胃肠黏膜的器官培养 309

十二、胚胎器官的上皮与间充质植块的联合培养 309

十三、肿瘤侵袭研究中的器官培养 311

(一)肿瘤细胞与靶器官植块的制备 312

(二)肿瘤细胞与器官植块几种联合培养模型 313

第四节 全胚胎培养 315

一、植入前胚胎培养 315

二、植入后胚胎培养 316

第五节 器官培养的应用 317

一、器官培养中的形态发生研究 317

二、器官培养与发育分化研究 319

(一)外分泌腺的发育分化 319

(二)内分泌腺的发育分化 321

(三)性腺及前列腺的发育分化 321

(四)神经组织的发育分化 322

(五)各组织细胞间的相互作用对器官分化的影响 322

三、体外培养整个胚胎的生长发育 324

四、胚胎致畸作用研究 324

五、器官的功能及其代谢研究 326

六、器官移植中的应用 326

(一)器官保存 326

(二)降低免疫原性 327

七、器官培养与肿瘤侵袭研究 328

第七章 培养物的观察检测方法 334

第一节 活细胞的观察检测方法 334

一、相差显微镜观察培养物的形态结构 334

(一)相差显微镜 334

(二)用相差显微镜观察活细胞的方法 336

(三)活细胞的动态观察与缩时电影 338

二、细胞计数法 339

三、细胞生长曲线 340

四、体外活体染色观察与活体染料 341

五、活细胞的染料排除检测法 342

六、细胞增殖活性测定的3H-TdR掺入法 342

七、细胞活力测定的MTT比色法 343

第二节 普通染色观察 343

一、HE染色法 343

二、吉姆萨染色法 344

三、载坡片处理方法 345

第三节 细胞化学技术 345

一、酸性磷酸酶 345

二、葡萄糖-6-磷酸酶 346

三、琥珀酸脱氢酶 347

四、DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法 348

五、DNA的富尔根(Feulgen)染色法 348

第四节 免疫细胞化学技术 349

一、常用免疫细胞化学技术原理 349

二、常用的显色标记物 351

(一)辣根过氧化物酶 351

(二)碱性磷酸酶 351

(三)荧光素 352

(四)胶体金与免疫金银技术 353

三、免疫细胞化学方法及标记物的选择 353

四、免疫细胞化学的一般问题 354

五、免疫细胞化学染色的典型程序 357

(一)免疫酶间接法 357

(二)免疫荧光LSAB法 357

(三)PAP法 357

(四)SPA-胶体金银法 358

第五节 原位杂交技术 358

一、探针与标记物的选择 358

二、原位杂交技术主要实验材料 359

三、杂交 362

四、显示标记物 364

五、设立对照 365

第六节 电子显微镜技术 365

一、超薄切片技术 366

(一)对培养物的预处理 366

(二)标本制备 367

二、电镜免疫细胞化学技术 370

(一)显示细胞表面抗原 370

(二)显示细胞内抗原 370

三、其它电镜技术简介 371

(一)扫描电镜技术 371

(二)冷冻蚀刻复型技术 372

第二部 分动物基本组织的体外培养 375

第八章 上皮组织的体外培养 375

第一节 上皮组织体外培养技术概论 375

一、在体生长与体外培养的上皮组织的基本特点 375

(一)上皮组织的形态结构 375

(二)上皮细胞的极性 376

(三)上皮细胞间的连接 377

二、体外培养的上皮组织细胞的生长生物学 377

(一)体外培养上皮细胞的形态结构 377

(二)体外培养上皮组织的生长与增殖特征 378

三、体外培养上皮组织细胞的观察与检测 381

(一)一般形态学观察 382

(二)组织化学与免疫组织化学观察与检测 382

第二节 呼吸系统有关的上皮细胞培养 383

一、呼吸道导气部上皮细胞的体外培养 383

二、呼吸道导气部上皮分泌细胞的悬浮培养 387

三、Ⅱ型肺泡细胞的培养 388

四、鼻咽上皮细胞的体外培养 390

第三节 消化系统有关的上皮细胞培养 392

一、食管黏膜上皮细胞的培养 392

二、胃黏膜上皮细胞的培养 394

三、肠黏膜上皮细胞的培养 395

四、胆囊和肝外胆管上皮细胞的培养 397

第四节 腺上皮细胞的体外培养 399

一、唾液腺上皮细胞的培养 399

二、乳腺上皮细胞的培养 401

(一)乳腺上皮细胞原代培养的建立和维持 401

(二)乳腺上皮细胞的悬浮培养 403

(三)乳腺上皮细胞在EHS基质上的培养 405

(四)乳腺上皮细胞的其它培养方法 406

(五)乳腺上皮细胞培养中的有关问题 408

第五节 表皮细胞的体外培养 409

一、表皮角质形成细胞的饲养层细胞培养法 409

二、角质形成细胞的复合培养法 412

(一)在人去表皮真皮上培养角质形成细胞 412

(二)在真皮替代物上培养角质形成细胞 414

三、表皮黑(色)素细胞的培养 415

四、表皮郎格汉斯细胞的培养 419

第六节 血管内皮细胞的体外培养 421

一、猪主动脉内皮细胞的培养 421

二、免主动脉内皮细胞的体外培养 424

三、人脐静脉内皮细胞的培养 425

四、大鼠主动脉内皮细胞的培养 426

五、滤膜培养法培养血管内皮细胞 427

六、免脑微血管内皮细胞培养 428

七、大鼠肺微血管内皮细胞的培养 429

第七节 胸腺上皮细胞的体外培养 430

第九章 结缔组织的体外培养 436

第一节 结缔组织细胞的生长生物学特点与基本分离技术 436

一、结缔组织细胞的生长生物学特点 436

二、体外培养结缔组织细胞的基本分离技术 440

第二节 结缔组织细胞培养各论 442

一、成纤维细胞的体外培养 442

(一)真皮成纤维细胞的体外培养 442

(二)人包皮成纤维细胞的无血清培养 445

(三)中国仓鼠胚胎成纤维细胞的体外培养 447

(四)鸡胚成纤维细胞的体外培养 448

(五)人胚肺成纤维细胞的体外培养 449

(六)小鼠肾间质成纤维细胞的体外培养 450

(七)眼组织成纤维细胞的体外培养 452

二、巨噬细胞的体外培养 452

(一)获取肺泡巨噬细胞的方法 453

(二)获取腹腔巨噬细胞的方法 453

(三)巨噬细胞的纯化 455

(四)巨噬细胞的接种和培养 455

三、脂肪细胞的体外培养 456

(一)大鼠前脂肪细胞的原代培养 457

(二)小鼠前脂肪细胞的原代培养 458

四、肥大细胞的体外培养 460

(一)肺肥大细胞的体外培养 460

(二)肠肥大细胞的体外培养 462

(三)皮肤肥大细胞的分离和短期培养 464

五、间充质干细胞的体外培养 465

(一)鸡胚肢芽间充质干细胞的体外培养 465

(二)大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养 467

(三)人骨髓间充质干细胞的体外培养 469

(四)兔骨髓间充质前体细胞的体外成软骨培养 470

第十章 几种重要脏器细胞与特殊动物细胞的体外培养 473

第一节 眼组织细胞的体外培养 473

一、角膜上皮细胞和内皮细胞的体外培养 473

(一)角膜上皮细胞的培养 473

(二)角膜内皮细胞的培养 475

二、小梁细胞的体外培养 476

三、视网膜色素上皮细胞的体外培养 478

四、晶状体上皮细胞的体外培养 481

五、视网膜米勒细胞的体外培养 482

第二节 骨与软骨组织的体外培养 484

一、成骨细胞的培养 485

(一)骨内成骨细胞的培养 485

(二)骨膜内成骨细胞培养 487

二、破骨细胞的培养 488

(一)成熟破骨细胞分离细胞培养法 489

(二)骨髓长时间培养诱导分仑形成破骨细胞法 490

三、滑膜细胞的培养 491

(一)滑膜植块培养法 492

(二)分离的滑膜细胞培养法 493

四、软骨细胞的培养 494

(一)关节软骨细胞的短期培养 494

(二)人关节软骨细胞的长期培养法 496

第三节 泌尿生殖系统有关的几种细胞培养 498

一、生精细胞的体外培养 498

二、睾丸支持细胞的培养 499

三、睾丸间质细胞的培养 501

四、肾小管上皮细胞的培养 502

五、肾小球系膜细胞的培养 504

第四节 几种内分泌细胞的体外培养 505

一、胰岛细胞的体外培养 505

二、人垂体腺瘤细胞培养 507

三、甲状腺细胞的体外培养 510

第五节 羊水细胞的体外培养 511

一、羊水细胞的体外培养基本方法 512

二、羊水细胞的富集培养法 513

第六节 胚胎干细胞的体外培养 514

一、体外培养胚胎干细胞的技术原理 515

二、体外培养胚胎干细胞的基本过程 515

(一)饲养层细胞的培养 515

(二)饲养单层的制备 518

(三)用于培养胚胎干细胞的条件培养基的制备 519

(四)胚胎干细胞的分离与培养 520

(五)胚胎干细胞的冻存与复苏 525

三、胚胎干细胞的鉴定 525

(一)碱性磷酸酶检测 525

(二)核型的鉴定 526

(三)体外分化能力观察 527

(四)体内分化能力的观察 527

(五)嵌合能力的测定 528

第十一章 造血干细胞的检测与造血祖细胞的体外培养 534

第一节 概论 534

一、造血干细胞的生物学特征 535

(一)造血干细胞的基本特性 535

(二)对造血干细胞的识别 536

(三)造血干细胞的胞龄结构 536

(四)造血干细胞的动力学 538

二、造血祖细胞 539

第二节 造血干细胞的测定技术 540

一、CFU-S的检测技术 541

二、以标记染色体测定脾结节的形成 543

三、脾结节移植法测定脾结节CFU-S 545

第三节 体外培养造血祖细胞的特殊实验材料 546

一、培养用液 546

二、特异性刺激因子的制备 549

(一)横纹肌条件培养液的制备 549

(二)白细胞条件培养液 551

(三)脾细胞条件培养液 551

(四)再障病人血清的制备 552

(五)胎肝细胞裂解液的制备 553

第四节 造血祖细胞的体外富集与培养 554

一、造血祖细胞的富集 554

(一)单个核细胞的分离 554

(二)CD34+细胞及其分离方法 557

(三)CD34+细胞的MACS免疫磁性分离方法 558

二、造血祖细胞的体外培养 559

三、各类造血祖细胞的培养技术 561

(一)CFU-GM的培养 561

(二)红系造血祖细胞的培养 564

(三)巨核造血祖细胞的培养 567

(四)混合细胞集落的培养 570

(五)白血病细胞的培养 571

(六)无血细胞体内扩散匣培养技术 571

四、造血细胞体内扩散匣培养技术 572

第五节 造血祖细胞培养技术的实际应用 574

一、正常人骨髓内各种造血祖细胞的含量测定 574

二、某些血液疾病的细胞病理学 575

三、药物对造血细胞的作用研究 576

四、再生障碍性贫血的发病机制和预后以及造血干细胞移植治疗 577

五、体外测定造血祖细胞辐射敏感性与全身放射敏感性反应的关系 580

第十二章 血淋巴细胞的体外培养 585

第一节 各类淋巴细胞的主要特征 585

一、T淋巴细胞 585

(一)T细胞的表面标志 585

(二)T细胞亚群及其功能 587

二、B淋巴细胞 587

(一)B细胞的表面标志 587

(二)B细胞的亚群 589

三、大颗粒淋巴细胞 589

(一)NK细胞 589

(二)K细胞 590

第二节 血淋巴细胞的分离 590

一、单个核细胞的分离 591

二、纯淋巴细胞的制备 593

(一)玻璃黏附法 593

(二)羰基铁粉法 593

三、T细胞和B细胞的分离 594

(一)T细胞花环沉降法 594

(二)尼龙毛柱分离法 596

四、大颗粒淋巴细胞的分离 597

五、荧光激活细胞分离仪分离淋巴细胞及其亚群 597

六、免疫磁珠法分离各种淋巴细胞及其亚群 599

第三节 血淋巴细胞的体外培养方法和应用 599

一、淋巴细胞转化试验 599

二、B细胞产生免疫球蛋白的检查 602

三、T细胞介导的细胞毒试验 603

四、NK细胞毒性试验 605

五、K细胞毒性试验 607

六、LAK细胞的制备 609

七、淋巴细胞的体外长期培养 610

(一)用IL-2建立T淋巴细胞克隆 610

(二)用EB病毒转化B淋巴细胞 611

(三)用B细胞生长因子建立B淋巴细胞株 612

第十三章 肌肉组织的体外培养 615

第一节 肌肉组织体外培养技术概论 615

一、肌肉组织体外培养技术的发展简史 616

二、肌肉组织细胞培养的意义与评价 617

第二节 心肌细胞的体外培养 618

一、心肌细胞培养的基本原理 618

二、心肌细胞培养用液 619

(一)常用平衡盐溶液 619

(二)心肌细胞培养液 619

(三)其它培养用液 621

三、心肌细胞的培养方法 621

(一)心肌细胞的原代培养 622

(二)成年动物的搏动心肌细胞的制备 625

(三)心肌细胞培养方法的某些发展 628

四、心肌细胞培养的基本结果与观测方法 630

(一)一般观察 630

(二)培养心肌细胞的形态学观察 630

(三)心肌细胞搏动的观察 632

五、培养心肌细胞的某些电生理特性 633

六、培养心肌细胞代谢的某些特点 634

第三节 平滑肌细胞的体外培养 636

一、平滑肌细胞体外培养方法 636

二、培养平滑肌细胞的结果与鉴定 640

三、影响血管平滑肌细胞增殖的因素 643

第四节 骨骼肌细胞的体外培养 643

一、骨骼肌细胞培养所需主要材料 644

二、骨骼肌细胞培养方法 646

(一)乌类骨骼肌细胞的培养 646

(二)啮齿类动物骨骼肌细胞原代培养方法 647

(三)从啮齿类动物肌肉中获取高纯度肌源性细胞的新方法 651

三、肌源性细胞系的建立 652

第十四章 神经组织的体外培养 656

第一节 神经元的体外培养 656

一、神经组织的植块培养法 656

(一)概述 656

(二)灰质组织或神经节的体外培养 657

(三)白质植块的培养 657

二、神经元的分离细胞培养方法 657

(一)材料的来源 658

(二)神经元体外培养液 658

(三)神经元体外培养的生长基质 661

(四)神经元的分离细胞培养过程 661

(五)神经元细胞的体外培养 661

三 神经干细胞的体外培养 663

第二节 神经胶质细胞的体外培养 663

一、星形胶质细胞的体外培养 663

(一)取材的动物年龄与部位 663

(二)星形胶质细胞的体外培养方法 665

(三)星形胶质细胞的无血清限定性培养液 666

(四)星形胶质细胞的形态学特征与化学标志物 666

二、少突胶质细胞的体外培养 667

(一)体外纯化过程 667

(二)体外培养少突胶质细胞的化学限定性培养基 668

(三)少突胶质细胞的化学标志物 668

(四)少突胶质细胞的形态学特征 669

三、施旺细胞的体外培养 669

(一)施旺细胞的体外培养方法 669

(二)施旺细胞的无血清限定性培养基 670

(三)施旺细胞体外生长的形态学特征与化学标志物 670

四、小胶质细胞的体外培养 671

(一)小胶质细胞的体外培养方法 671

(二)小胶质细胞的形态学特征与鉴定 671

五、其它神经胶质细胞的体外培养 672

六、体外培养神经组织分离细胞的形态学特征比较 672

第三节 各类神经组织细胞的培养方法 673

一、鸡胚背根节的体外培养 673

二、大鼠颈上神经节的体外培养 676

三、大鼠小脑皮质神经元的体外培养 676

四、大鼠星形胶质细胞的体外培养 678

(一)方法一：植块培养法 678

(二)方法一：分离细胞培养法 679

五、大鼠少突胶质细胞的体外培养 682

(一)方法一：植块培养法 683

(二)方法二：密度梯度离心法 683

(三)方法三：恒温摇床处理法 684

六、大鼠施旺细胞的体外培养 686

(一)方法一：常规分离细胞培养法 686

(二)方法二：免疫选择法 687

(三)方法三：反复植块法 689

七、鼠脑小胶质细胞的体外培养 689

八、脊髓神经元的体外培养 690

(一)方法一：差速黏附处理富集脊髓神经元培养法 690

(二)方法二：台面选淘富集脊髓前角运动神经元培养法 692

九、鼠脑神经干细胞的体外培养 695

(一)胚胎神经干细胞的体外培养 695

(二)成年脑组织内神经干细胞的体外培养 698

十、大鼠胚胎几种常用脑区组织体外培养的取材 699

第三部分 特殊类动物细胞的体外培养 705

第十五章 肿瘤细胞的体外培养 705

第一节 肿瘤细胞在体内和体外的生长特性概论 706

一、肿瘤细胞在体内生长的特征 706

二、肿瘤细胞在体外的生长生物学特性 707

三、肿瘤细胞在体内和体外的生长特征差别 708

四、体外培养肿瘤细胞常用的培养基 709

第二节 体外培养肿瘤组织细胞的方法和技术 710

一、肿瘤组织细胞的原代培养 710

二、肿瘤细胞的传代 715

三、肿瘤细胞的克隆培养法 716

第三节 肿瘤细胞体外生长的细胞生物学特征 718

一、肿瘤细胞体外生长的形态学与细胞学特征 718

二、肿瘤细胞的核型和异常生长特性 720

(一)染色体数目及核型 720

(二)永生性 721

(三)异质性 723

(四)动物接种成瘤性 724

(五)非锚着生长依赖性 724

第四节 已建立的肿瘤细胞系介绍 725

一、国内已建立的人类肿瘤细胞系介绍 725

二、国际上已建立的人类肿瘤细胞系 726

第五节 部分肿瘤细胞的体外培养与建系过程 727

一、人鼻咽癌细胞系(CNE-2)的建立 727

二、人骨肉瘤细胞系(HOS-8603)的建立 728

三、大鼠肝卵圆细胞的本外培养 730

四、人神经母细胞瘤细胞系的建立 731

五、人肺腺癌细胞系的建立 732

六、有肺巨细胞癌细胞系的建立 732

七、人肾颗粒细胞癌细胞系的建立 733

八、人卵巢癌细胞系的建立 734

九、人肝癌细胞系的建立 734

十、人喉腺泡型横纹肌肉瘤细胞系的建立 735

十一、人恶性胸膜间皮瘤细胞系的建立 736

十二、人乳腺癌细胞系(HATTORI)的建立 736

第六节 肿瘤细胞培养的应用 737

一、肿瘤细胞对组织浸润的体外研究 737

二、人恶性肿瘤细胞的动物移植瘤研究 740

三、培养肿瘤细胞的体外分化实验 742

四、培养肿瘤细胞的凋亡诱导研究 745

第十六章 病原微生物的培养 750

第一节 病原微生物培养技术概论 750

一、病原微生物培养的基本原理 751

二、病原微生物培养的基本方法和技术 752

三、病原微生物培养的应用 754

第二节 细菌的培养 755

一、细菌培养的基本条件 755

(一)细菌培养基 755

(二)细菌生长的其它条件 756

二、细菌生长繁殖的特点 757

三、细菌培养的基本技术 758

(一)无菌操作技术 758

(二)细菌接种技术 758

四、细菌培养的方法 760

(一)一般培养法 760

(二)二氧化碳培养法 760

(三)厌氧培养法 761

五、各别类细菌的培养 762

(一)致病性葡萄球菌的培养 762

(二)幽门螺旋杆菌的培养 764

(三)结核杆菌的培养 766

(四)淋球菌(淋病奈瑟氏菌)的培养 767

第三节 其它类菌的培养 769

一、放线菌的培养 769

(一)放线菌培养的一般条件 769

(二)放线菌培养基 769

二、真菌的培养 770

(一)真菌培养的一般条件 770

(二)常见致病真菌的培养基 771

三、支原体培养 772

(一)支原体培养的一般条件 772

(二)常见病原支原体的培养基 773

四、立克次体的培养 774

(一)立克次体培养的一般条件 774

(二)常见病原立克次体的培养 775

五、衣原体培养 775

(一)衣原体培养的一般条件 775

(二)常见的病原性衣原体的培养 776

六、螺旋体的培养 776

(一)螺旋体培养的一般条件 776

(二)钩端螺旋体培养基 777

(三)常见病原螺旋体的培养 778

第四节 病毒的培养 778

一、宿主细胞培养法 779

二、鸡胚培养法 780

三、各别类宿主细胞培养法 782

(一)EB病毒的培养 782

(二)脊髓灰质炎病毒的培养 784

(三)乙型肝炎病毒DNA转染细胞系的建立和应用 787

第十七章 医学寄生虫的体外培养 790

第一节 寄生虫的体外培养技术概论 790

一、寄生虫的营养与代谢特点 790

二、寄生虫的体外培养技术类别 791

(一)寄生虫虫体培养 791

(二)寄生虫细胞培养 792

(三)寄生虫的体外培养常用培养基 792

三、寄生虫体外培养技术的应用 794

(一)在生物学研究中的应用 794

(二)在病理与免疫学研究中的应用 795

(三)在药物学研究中的应用 796

第二节 疟原虫体外培养 797

一、疟原虫红外期体外培养 797

(一)约氏疟原虫红外期的体外培养 797

(二)人疟原虫红细胞外期体外培养 799

二、疟原虫红内期体外培养 801

(一)体外长期连续培养 801

(二)同步培养法 803

(三)疟原虫冷冻保存技术 804

三、恶性疟原虫配子体的体外培养 804

第三节 机会性致病原虫的体外培养 807

一、弓形虫的体外培养 807

(一)速殖子的培养方法之一：单层贴壁细胞接种培养法 807

(二)速殖子的培养方法之二：悬浮细胞的接种培养法 809

(三)速殖子的培养方法之三：在鸡胚中种植的培养法 809

(四)包囊的培养 810

(五)弓形虫的冷冻保存技术 811

二、卡氏肺孢子虫体外培养 812

(一)用非洲绿猴肾细胞系培养卡氏肺孢子虫 813

(二)用胎儿肺成纤维细胞系培养卡氏肺孢子虫 814

三、隐孢子虫体外培养 814

(一)在组织细胞内培养 815

(二)在鸡胚中培养 816

第四节 日本血吸虫体外培养 816

一、培养基及培养条件 817

(一)培养基的种类 817

(二)培养条件 817

二、各期培养方法 818

(一)尾蚴人工转变童虫体外培养 818

(二)肺期童虫体外培养 819

(三)成虫体外培养 820

(四)虫卵的体外培养 821

(五)毛蚴至母胞蚴的体外培养 821

(六)子胞蚴和尾蚴的体外培养 822

(七)血吸虫成虫和童虫细胞的培养 823

第五节 棘球绦虫体外培养 823

一、细粒棘球绦虫的体外培养 824

(一)囊型发育 824

(二)链体发育 825

(三)成虫体外培养 825

(四)细胞培养 826

二、多房棘球绦虫体外培养 827

(一)多房棘球绦虫虫体培养 827

(二)多房棘球绦虫细胞培养 828

第十八章 无脊椎动物组织的体外培养 832

第一节 无脊椎动物细胞培养的基本方法和技术 833

一、体外培养无脊椎动物细胞的基本条件 833

(一)无脊椎动物细胞培养基 833

(二)无脊椎动物细胞常用培养基的配方 835

(三)昆虫组织培养基的配制 847

(四)体外培养无脊椎动物细胞的其它条件 849

二、无脊椎动物细胞的原代培养 850

三、无脊椎动物细胞的传代培养 852

四、无脊椎动物细胞的悬浮培养 854

五、培养细胞的低温保存和冷冻保存 855

第二节 无脊椎动物的器官培养 855

一、软体动物器官的体外培养 856

二、蠊翅目昆虫的体外器官培养 856

第三节 无脊椎动物细胞系(株)的建立 859

一、昆虫细胞系的建立 859

(一)鳞翅目 859

(二)双翅目 862

(三)蠊翅目 864

二、昆虫缺陷型细胞株的建立 867

三、软体动物细胞系的建立 868

(一)蜗牛细胞系的建立 869

(二)牡蛎细胞的离体培养 874

四、蜱螨(扁虱)细胞系的建立 876

五、建立细胞系的注意事项 881

第四节 无脊椎动物细胞的大规模培养 882

一、大规模悬浮细胞培养的添加剂 882

二、低剪切力连续生物反应器 884

三、有血清培养基扩大规模培养昆虫细胞技术 884

(一)扩大规模培养的主要材料 885

(二)扩大规模培养方法 886

四、无血清培养基扩大规模培养昆虫细胞技术 888

第四部分 体外培养技术的应用 897

第十九章 体外培养的应用技术 897

第一节 细胞分化与体外诱导分化 897

一、正常细胞分化 897

二、EC、ES和EG细胞系 898

三、ES和EG细胞培养和建系的基本技术 899

(一)饲养层细胞 899

(二)胚胎细胞来源 900

(三)ES和EG细胞的培养过程 900

(四)ES和EG细胞系特性和鉴定 902

四、ES细胞体外诱导分化 904

(一)ES细胞体外诱导分化的意义 904

(二)ES细胞体外诱导分化的基本原理 905

(三)ES细胞体外诱导分化的基本方法 905

(四)ES细胞体外分化的细胞类型 907

五、诱导分化细胞的永生化 911

第二节 细胞融合技术 911

一、病毒融合法 912

二、聚乙二醇诱导细胞融合法 914

三、电诱导细胞融合法 915

第三节 体外受精技术 917

一、体外受精的基本实验条件 918

(一)体外受精所需的主要仪器设备和消耗用品 918

(二)体外受精与胚胎培养环境的设备和管理 919

(三)胚胎培养液 919

二、胚胎的体外培养 922

(一)卵母细胞的收集 922

(二)精子的体外获能 923

(三)体外受精 925

(四)卵裂观察及胚胎评分 927

三、胚胎移植 928

第四节 基因转染技术与体外细胞转化 929

一、基因转染技术 930

(一)待转染细胞的准备 930

(二)质粒DNA的纯化 931

(三)基因转染的方法 932

(四)转染细胞的筛选 936

二、体外细胞转化 937

(一)细胞转化的概念与细胞转化的过程 937

(三)诱变因素诱发培养细胞转化的程序 938

三、转基因动物 939

第五节 杂交瘤技术与单克隆抗体制备技术 940

一、杂交瘤技术 940

(一)B淋巴细胞杂交瘤技术的实验流程 941

(二)应用于杂交瘤技术中的培养用液 942

(三)杂交瘤细胞的染色体分析 943

(四)杂交瘤细胞的染色体分析 948

二、单克隆抗体 949

(一)单克隆抗体的概念 949

(二)单克隆抗体的鉴定 950

(三)单克隆抗体的生产和提纯 952

(四)单克隆抗体技术的发展 953

第二十章 动物细胞大规模培养 958

第一节 动物细胞培养有关的特性 959

一、动物与微生物细胞的差别 959

二、动物细胞生长特性 960

第二节 发酵 960

一、培养方法 961

(一)贴壁培养 961

(二)悬浮培养 962

(三)固定化培养 962

二、动物细胞培养的发酵工艺 964

(一)分批式培养 965

(二)流加式培养 966

(三)半连续式培养 966

(四)连续式培养 967

(五)灌注培养 967

三、发酵工艺条件及其控制 968

(一)培养基 968

(二)培养温度的调节控制 969

(三)培养液酸碱度的调节控制 969

(四)溶解氧的调节控制 969

四、动物细胞大规模培养用生物反应器 974

(一)搅拌罐生物反应器 974

(二)气升式生物反应器 979

(三)鼓泡式生物反应器 981

(四)中空纤维生物反应器 982

第三节 动物细胞微载体培养技术 984

一、动物细胞在微载体表面的贴壁生长机制 985

二、微载体的主要特性 986

三、微载体的种类及其性质 987

(一)交联葡聚糖为基质的微载体 987

(二)塑料为基质的微载体 988

(三)明胶/变性胶原微载体 988

(四)玻璃为基质的微载体 988

(五)纤维素为基质微载体 989

(六)液膜微载体 989

(七)大孔微载体 989

四、微载体的选择 993

第四节 动物细胞大规模培养技术的应用 993

一、在疫苗生产上的应用 994

二、在干扰素生产上的应用 994

三、在单克隆抗体生产上的应用 994

四、在其它基因重组产品生产上的应用 995

第五部分 植物组织细胞的培养 999

第二十一章 植物组织细胞培养的基本原理与技术 999

第一节 植物组织细胞培养技术的概念和类别 999

一、植物组织细胞培养的基本概念 999

二、植物组织细胞培养技术的类别 1001

第二节 植物组织培养技术的发展简史 1002

一、植物组织细胞培养技术的创立阶段 1002

二、植物组织细胞培养技术的发展阶段 1004

三、植物组织细胞培养技术的应用研究阶段 1006

第三节 植物组织细胞培养技术概述 1007

一、植物组织细胞培养的基本条件 1007

(一)植物组织细胞培养的营养条件 1007

(二)植物组织细胞培养的环境条件 1009

二、植物组织细胞培养的基本方法和技术 1011

(一)植物组织细胞培养的基本方法 1011

(二)植物组织细胞培养的基本技术 1011

三、植物组织细胞培养的基本程序 1013

四、植物组织细胞培养物离体生长的基本方式 1015

(一)直接芽分化的方式 1016

(二)通过愈伤组织形成的方式 1016

(三)胚状体形成的方式 1020

五、植物组织细胞培养物的鉴定 1021

(一)植物组织培养物的组织学观察 1021

(二)植物组织培养物的染色体观察 1023

六、植物组织培养技术与动物组织培养技术的异同 1025

第四节 植物组织细胞离体培养时的生物学特征 1026

一、植物组织细胞离体培养条件下的全能性 1026

(一)植物组织细胞的全能性具有普遍性 1026

(二)植物组织细胞全能性实现的途径 1027

二、植物组织细胞离体培养条件下的突变性 1029

(一)植物组织细胞的变异性具有广泛性 1029

(二)离体培养的植物组织细胞变异机制 1031

三、植物组织细胞离体培养条件下的类减数分裂现象 1034

(一)植物组织细胞类减数分裂现象的存在 1034

(二)体细胞类减数分裂发生的机制 1035

第二十二章 植物组织细胞培养各论 1037

第一节 植物的胚胎培养 1037

一、植物胚胎培养的概念 1037

二、植物的幼胚培养 1038

(一)幼胚培养的基本过程 1038

(二)植物幼胚培养的实例 1041

三、植物的成熟胚培养 1042

四、植物的胚珠培养 1042

(一)胚珠培养的基本过程 1043

(二)胚珠培养的实例 1044

五、子房的培养 1046

(一)子房培养的基本过程 1046

(二)植物子房培养实例 1048

六、植物的胚乳培养 1049

(一)胚乳培养的基本过程 1050

(二)植物的胚乳培养实例 1052

第二节 植物的器官培养 1053

一、植物器官培养的概念 1053

二、离体根培养 1053

(二)根培养的基本过程 1054

(二)植物离体根的培养实例 1055

三、离体茎培养 1056

(一)离体茎培养的基本过程 1056

(二)植物茎尖培养的实例 1060

四、离体叶培养 1062

(一)叶培养的基本过程 1062

(二)叶器官培养的实例 1063

五、植物花器官的培养 1064

(一)花培养的基本过程 1064

(二)花器官培养的实例 1065

六、植物种子和果实培养 1066

(一)种子和果实培养的基本过程 1067

(二)植物种子和果实培养的实例 1068

第三节 植物的组织培养 1069

一、植物的组织培养概念 1069

二、植物愈伤组织的培养 1069

三、植物胚性愈伤组织的培养 1071

(一)植物胚性愈伤组织培养的基本过程 1071

(二)植物愈伤组织培养及植株再生实例 1074

第四节 植物的细胞培养 1076

一、植物细胞培养的概念 1076

二、植物细胞悬浮培养 1076

(一)植物细胞悬浮培养的基本过程 1076

(二)悬浮细胞的培养实例 1086

三、植物的单细胞培养 1087

(一)植物单细胞培养的基本过程 1087

(二)植物单细胞培养实例 1091

第五节 植物的花药与花粉培养 1092

一、植物花药与花粉培养的概念 1092

二、植物的花药培养 1092

(一)花药培养的基本过程 1092

(二)植物花药培养实例 1098

三、植物的花粉培养 1099

(一)花粉培养的基本过程 1099

(二)植物花粉培养实例 1102

第六节 植物的原生质体培养 1103

一、原生质体培养的概念 1103

二、原生质体的培养 1103

(一)原生质体培养的基本过程 1103

(二)原生质体培养实例 1115

第二十三章 植物组织细胞培养的应用 1118

第一节 植物组织细胞培养的应用技术 1118

一、植物基因转移技术 1118

(一)植物基因的获取 1118

(二)植物基因的载体 1120

(三)植物基因的转移方法 1120

(四)转基因植物的检测 1123

(五)植物基因转移实例 1126

二、植物体细胞融合技术 1129

(一)原生质体融合的基本方法 1129

(二)原生质融合体的生长发育 1134

(三)原生质体融合实例 1137

三、植物体外受精技术 1137

四、快速繁殖植物技术 1139

第二节 植物组织细胞培养在农业上的应用 1141

一、利用植物组织培养技术改良植物品质 1141

(一)利用植物组织培养技术进行倍性育种 1142

(二)利用植物组织培养技术进行远缘杂交育种 1146

(三)利用植物细胞培养技术进行突变育种 1149

二、利用植物组织培养技术培育脱毒植物 1157

(一)利用茎尖培养技术进行植物脱毒 1157

(二)利用植物组织培养技术进行植株脱毒 1159

(三)利用植物组织培养技术快速繁殖植物 1160

三、利用植物组织培养技术保存植物种质 1162

(一)植物组织细胞超低温保存的优点 1162

(二)植物组织细胞超低温保存技术 1162

(三)植物超低温种质保存实例 1165

四、利用植物组织培养技术合成人工种子 1167

(一)人工种子的特点 1167

(二)人工种子的应用前景 1168

(三)人工种子制作的基本技术 1169

(四)人工种子制作实例 1172

第三节 植物组织细胞培养技术与植物产品生产 1173

一、利用植物组织细胞培养技术工厂化生产试管苗 1173

(一)用植物组织细胞培养技术建立植物的无性系 1173

(二)试管苗工厂化生产实例 1176

二、利用植物细胞大量培养技术生产植物产品 1179

(一)培养的植物组织细胞积累次生代谢物的特点 1180

(二)培养的植物组织细胞积累的次生代谢物之类别 1180

(三)利用植物组织细胞培养技术生产次生代谢物的方法 1180

(四)利用植物组织细胞培养生产次生代谢物的实例 1182

第四节 利用植物细胞培养技术生产植物药 1185

一、利用植物细胞培养技术生产植物药的优势和不足 1185

二、利用植物组织培养技术生产的植物药的类别 1186

三、植物药物生产的主要技术 1187

(一)发状根培养技术 1187

(二)两相培养技术 1188

(三)反义技术 1189

四、利用植物组织细胞技术生产植物药的实例 1190

五、植物药工业化生产实例 1194

附录 1196

附录Ⅰ无血清培养基及添加剂供应商一览表 1196

附录Ⅱ水合物的等量值表 1197

附录Ⅲt界值表 1198

附录Ⅳ离心机转速(r/min)与相对离心力(RCF)的列线图 1199