遗传工程概论 第2版PDF电子书下载

第一章 引言 1

一、遗传工程的概念 1

二、遗传工程的发展概况 2

三、遗传工程所需的微生物学原理 8

（一）大肠杆菌的一般特性 8

（二）抗生素抗性 9

（三）细菌细胞的生长 9

第二章 遗传工程的载体 12

一、质粒载体 12

（一）质粒的复制 12

1.质粒的复制起始和控制 12

2.质粒的不相容性 13

（二）质粒的改造 14

（三）目前常用的质粒载体 14

1.带有多克隆位点的质粒 15

2.带有噬菌体启动子的质粒 15

3.表达质粒 15

二、单链噬菌体克隆载体 17

（一）M13噬菌体 17

（二）α互补 18

（三）M13及其寄主的改造 18

（四）噬菌粒 19

三、双链噬菌体克隆载体 19

（一）λ噬菌体的基因组结构与侵染 20

1.λ噬菌体的生活周期 20

2.λ噬菌体的基因组结构 20

3.λ噬菌体的侵染 20

（二）λ噬菌体载体的构建 22

1.生物学制约 24

2.载体的通用性 24

3.体外包装 24

四、粘粒载体 25

第三章 DNA的提取 28

一、原核生物染色体DNA的提取 28

二、原核生物染色体外DNA的分离 28

三、质粒DNA的快速提取 31

四、真核生物染色体DNA的提取 31

五、DNA浓度和纯度的光学分析 32

第四章 遗传工程的酶学基础 34

一、限制性内切酶 34

（一）寄主的限制和修饰 34

（二）限制性内切酶的类别 36

1.第一类限制性内切酶 36

2.第二类限制性内切酶 36

3.第三类限制性内切酶 40

（三）限制性内切酶的纯化 40

（四）限制性内切酶反应的终止 41

二、DNA聚合酶 41

（一）E.coli DNA聚合酶I 41

（二）E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段 42

（三）T4 DNA聚合酶 43

（四）天然的T7 DNA聚合酶 45

（五）修饰的T7 DNA聚合酶 45

（六）Taq DNA聚合酶和反转录酶 46

三、依赖于DNA的RNA聚合酶 46

四、DNA及RNA的修饰酶 47

（一）末端脱氧核苷酸转移酶 47

（二）T4多核苷酸激酶 47

（三）碱性磷酸酶 48

五、核酸酶 48

（一）DNA酶I 48

（二）Bal 31核酸酶 49

（三）S1核酸酶 50

（四）外切核酸酶III 50

（五）核糖核酸酶H 51

第五章 凝胶电泳和杂交分析 52

一、凝胶电泳 52

（一）基本原理 52

（二）DNA的可见性 53

（三）电泳图谱 53

（四）凝胶系统 54

（五）实验条件对凝胶电泳的影响 54

（六）指示染料和加样缓冲液 55

（七）DNA分子大小的确定 55

（八）DNA的回收 56

二、杂交分析 57

（一）Southern吸印和杂交分析 57

（二）Northern吸印和杂交分析 59

（三）Western印迹检测技术 59

（四）DNA的斑点杂交 59

（五）探针的制备 60

1.缺口平移法 60

2.随机引物法 61

3.液体闪烁计数 61

4.非放射性探针 62

（六）DNA芯片技术 63

第六章 DNA的连接 67

一、大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶 67

二、DNA片段在体外的连接 69

（一）粘性末端的连接 70

（二）平齐末端的连接 70

（三）非互补末端的连接 70

（四）接头的使用 72

1.linker 72

2.adaptor 73

三、影响连接反应的因素 74

四、提高连接反应效率的两项措施 75

第七章 细菌转化 77

一、细菌转化的原理 77

二、细菌转化的方法 79

（一）简便、快速的感受态制备和转化方法 79

（二）标准的高效转化法 80

（三）“超级感受态”细胞的制备和转化 80

（四）菌落转化法 80

（五）X1776的转化方法 81

（六）电击转化 81

三、转化的评估指标 82

（一）转化效率（转化频率） 82

（二）感受态细胞的比例 82

第八章 理想克隆的鉴定 83

一、表现型的鉴定 83

（一）利用抗生素进行筛选 84

（二）利用显色进行筛选 84

二、限制性作图分析 86

（一）限制性作图 86

（二）限制性分析与Southern杂交相结合 88

三、菌落和噬菌斑的原位杂交 88

（一）菌落原位杂交 88

（二）噬菌斑原位杂交 88

（三）原位杂交的优越性和进一步的鉴定 90

四、用PCR扩增目的片段 90

五、免疫检测法 90

（一）用免疫检测法筛选表达文库的过程 91

1.筛选噬菌斑构成的表达文库 91

2.筛选菌落构成的表达文库 91

（二）关于免疫检测法的几个问题 91

1.多克隆抗体和单克隆抗体 91

2.多克隆抗体的来源 92

3.第一抗体的检测 92

4.第二抗体的来源 92

5.对酶促发色法和放射化学法进行比较 93

6.对碱性磷酸酶与抗体的偶联物和辣根过氧化物酶与抗体的偶联物进行比较 93

7.诱导外源蛋白表达的时间 93

六、酵母人工染色体文库的筛选 93

（一）YAC基因组文库的保存 94

（二）YAC基因组文库的筛选方法 94

（三）构建、贮存和筛选的分工 95

（四）筛选YAC文库的流程 95

第九章 克隆基因在大肠杆菌细胞中的表达 97

一、外源基因在大肠杆菌细胞中表达的原理和技术 97

（一）表达系统的选择 97

1.蛋白质的大小 97

2.蛋白质的活性 97

3.蛋白质的需要量 97

（二）启动子的选择 97

1.乳糖操纵子的启动子（lac UV5启动子） 97

2.色氨酸启动子（trp启动子） 98

3.乳糖操纵子和色氨酸操纵子的复合启动子（tac或trc启动子） 98

4.噬菌体T7启动子 98

（三）融合蛋白质的表达 98

1.融合蛋白质表达的特点和载体 98

2.融合蛋白质的分离 99

（四）促使基因表达“天然的”蛋白质产物 99

（五）提高外源蛋白质的稳定性 100

二、优化外源基因在大肠杆菌中表达的原理和技术 100

（一）构建最合适的启动子 100

（二）使翻译起始尽可能完善 101

（三）密码子的选择 101

1.密码子的选择与细胞中tRNA的丰度相关 101

2.在嘧啶结尾密码子中对第三位上嘧啶的非随机选择 101

（四）质粒的拷贝数及其稳定性 101

（五）寄主细胞的生理状态 102

第十章 cDNA文库技术 103

一、cDNA文库的构建 104

（一）对cDNA文库的要求 104

（二）mRNA的分离纯化 105

（三）cDNA第一链的合成 105

（四）cDNA第二链的合成 106

（五）cDNA的克隆 107

（六）cDNA的载体引导合成法 110

（七）构建cDNA文库的载体系统 111

二、cDNA文库的筛选 113

（一）菌落和噬菌斑的原位杂交 113

1.差示杂交筛选 113

2.扣除cDNA探针 114

3.合成寡聚核苷酸探针或引物 114

（二）用PCR的方法筛选cDNA文库 116

（三）特异配体与蛋白质相结合的方法 117

（四）酵母双杂分析法 117

1.工作原理 118

2.做法 119

第十一章 基因组文库的构建 121

一、用于λ载体的外源DNA的制备 123

（一）机械切割 123

（二）限制性内切酶的部分消化 124

二、λ载体DNA的制备 126

（一）双酶消化法 127

（二）λ Charon 4A载体DNA的制备 128

三、连接、体外包装和侵染大肠杆菌 128

四、噬菌体λ和粘粒两种载体构建的基因组文库的比较 129

五、YAC、BAC、PAC文库 129

（一）YAC文库 129

（二）BAC文库 131

（三）PAC文库 132

第十二章 DNA的序列分析 136

一、Maxam和Gilbert的化学测序法 137

（一）方法 137

（二）原理 138

（三）专门用于化学测序的载体 140

二、Sanger的双脱氧测序法 142

（一）原理 142

（二）过程 142

（三）关于双脱氧测序法的若干问题 142

三、双脱氧测序与M13克隆系统相结合 144

四、自动化测序和热循环测序 146

（一）自动化测序 146

（二）热循环测序 147

五、双脱氧测序法和化学测序法的比较 147

六、DNA大片段的测序 147

（一）随机测序法 147

（二）利用嵌套式缺失体进行测序 148

1.利用外切核酸酶III构建嵌套式缺失体并测序 148

2.利用Bal 31核酸酶构建嵌套式缺失体并测序 149

3.洪国藩的DNA系统测序策略 151

（三）引物步移法 152

七、基因组测序 153

第十三章 聚合酶链式反应 155

一、聚合酶链式反应的原理 155

二、聚合酶链式反应的必要条件 157

（一）引物设计 157

（二）PCR的温度 158

（三）PCR的反应体系 159

三、聚合酶链式反应的应用 160

（一）原位PCR 160

（二）RT-PCR 160

（三）差异显示反转录酶PCR 162

（四）单侧PCR 164

1.3′RACE 164

2.5′RACE 164

（五）反向PCR 166

（六）鉴定甲基化的PCR 167

第十四章 克隆化DNA的定点诱变 169

一、盒式诱变 169

二、寡核苷酸介导的诱变 172

（一）Kunkel定点诱变法 172

（二）硫代核苷酸负链诱变法 173

三、PCR诱变 174

（一）重叠延伸诱变法 174

（二）大引物诱变法 176

（三）掺入诱变引物的PCR扩增 179

（四）基于PCR的诱变鉴定 180

第十五章 图位克隆法 184

一、遗传连锁图 184

（一）DNA分子标记 185

1.RFLP 185

2.RAPD 188

3.AFLP 189

4.SSR 191

5.STS 192

（二）植物遗传图谱的构建 194

1.亲本的选择和作图群体的建立 194

2.作图程序 195

（三）近等基因系和集团分离分析 196

1.近等基因系 196

2.集团分离分析 197

3.近等基因系和集团分离分析的作用 198

（四）主效基因的定位 198

1.利用已有的遗传图谱进行定位 198

2.在构建分子图谱的同时进行定位 198

二、物理图 199

（一）物理图的类型 199

1.限制性酶切图谱 199

2.重叠群图谱 199

3.DNA序列图谱 203

（二）长距离物理作图 203

三、图位克隆法的主要策略和相关技术 203

（一）染色体步移 203

1.图位克隆法中的染色体步移 204

2.YAC末端的遗传作图 204

3.目标基因的鉴定 205

4.有关染色体步移的几个问题 205

（二）染色体登陆 206

1.染色体登陆的含义 206

2.染色体登陆对分子标记的要求 206

3.染色体登陆的具体步骤 206

4.染色体登陆的实例 207

5.染色体登陆的优越性及其应用前景 207

（三）相关技术 207

1.质粒挽救法 207

2.反向PCR法 208

3.TAIL-PCR法 209

第十六章 酿酒酵母的遗传工程 214

一、酵母菌的质粒 215

（一）天然的酵母菌质粒 215

（二）人工构建的酵母菌质粒 216

1.酵母菌的整合型质粒 217

2.酵母菌的游离型质粒 218

3.酵母菌的复制型质粒 218

4.酵母菌的着丝粒质粒 218

5.酵母菌的线状质粒 219

二、酵母菌基因的克隆 219

（一）酵母菌基因在大肠杆菌中的表达 219

（二）利用大肠杆菌突变体克隆酵母菌基因 220

（三）利用酵母菌突变体克隆酵母菌基因 220

（四）酵母菌的转化 221

1.利用乙酸锂进行转化 221

2.利用原生质体进行转化 221

三、外源基因在酵母菌中的表达 222

（一）酵母菌的表达载体 222

（二）影响表达的因素 223

（三）蛋白质的分泌 223

（四）内含子切除问题 224

四、利用酵母菌研究分子生物学 224

（一）基因融合系统 224

（二）克隆化基因与酵母染色体的整合 225

（三）基因置换技术 226

1.基因破坏一步法 226

2.PCR介导的基因破坏一步法 226

3.移换 226

4.用一步整合置换创造修饰基因 228

（四）回收者载体的应用 230

第十七章 植物基因工程 233

一、概论 233

（一）植物基因工程的受体 233

（二）植物基因工程载体 233

二、农杆菌介导的基因转移 235

（一）农杆菌转化载体的改造 236

1.Ti质粒的一般特性 236

2.整合载体 237

3.双元载体 237

（二）农杆菌转化技术 237

1.农杆菌的寄主范围 237

2.农杆菌转化的方法 237

三、其他植物转基因方法 239

（一）基因枪转化系统 239

1.基因枪转化的原理和特点 239

2.影响基因枪转化的因素 240

（二）原生质体转化系统 241

1.电击法 241

2.PEG介导法 242

3.脂质体介导法 242

（三）生殖细胞转化 242

1.花粉介导的遗传转化 242

2.子房作为受体 243

（四）病毒载体法 243

四、转化体的鉴定和分析 243

（一）转化体的选择 243

（二）转化体的鉴定 244

（三）外源基因的整合特性 245

（四）外源基因在转化体中的表达情况 245

（五）外源基因在转化体中的传代分离及其稳定性 246

五、转基因技术在植物育种上的应用 247

（一）抗病毒基因工程 247

（二）抗虫性基因工程 247

（三）抗除草剂基因工程 247

（四）抗真菌、细菌病害的基因工程 248

第十八章 哺乳动物的基因工程 249

一、动物基因工程载体系统 249

（一）反转录病毒载体 249

1.一般特性 249

2.反转录病毒载体的构建 250

（二）SV40病毒载体 253

1.一般特性 253

2.SV40载体的构建 255

（三）腺病毒载体 257

1.一般特性 257

2.腺病毒载体的构建方法 258

（四）腺相关病毒载体 258

（五）单纯疱疹病毒载体 258

（六）牛痘病毒载体 259

（七）牛乳头瘤病毒载体 259

（八）非病毒载体 260

二、动物基因工程的标记基因 260

（一）选择标记基因 260

1.胸苷激酶基因 261

2.黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）基因 262

3.氨基葡萄糖苷3′-磷酸转移酶基因 262

4.二氢叶酸还原酶基因 263

（二）报告基因 263

1.氯霉素乙酰转移酶基因 263

2.β-半乳糖苷酶基因 264

3.碱性磷酸酶基因 264

4.萤光素酶基因 264

5.绿色荧光蛋白基因 264

6.红色荧光蛋白基因 265

三、外源基因的导入与表达 265

（一）哺乳动物细胞的基因导入方法 265

1.磷酸钙沉淀法 265

2.脂质体介导法 266

3.电击法 266

（二）动物转基因技术 266

1.胚胎显微注射 267

2.反转录病毒载体 267

3.胚胎干细胞方法 268

4.精子介导基因转移法 268

（三）外源基因在哺乳动物细胞中的表达 268

1.瞬时表达 268

2.外源基因整合后的表达 269

（四）外源基因在转基因动物中的表达 269

四、基因打靶与体细胞克隆技术 269

（一）基因打靶的分子生物学基础 270

（二）基因打靶载体 270

1.插入型载体 271

2.置换型载体 271

（三）基因打靶的策略 271

1.基因敲除 271

2.进退策略 272

3.标记和交换策略 272

4.双置换法 273

5.Cre／loxP重组系统策略 273

（四）基因打靶的筛选和选择系统 274

1.物理筛选 275

2.遗传选择 275

（五）体细胞基因打靶 276

（六）体细胞克隆技术 277

1.受体细胞的选择与去核 278

2.供体细胞的选择 278

3.核移植与重构胚的激活 278

五、转基因动物的应用 279

（一）动物乳腺生物反应器 279

（二）动物血液生物反应器 280

（三）抗病育种 280

（四）生产性能的改良 281

（五）异种器官移植 281

第十九章 用重组DNA技术生产药物 285

一、胰岛素 285

（一）人胰岛素的结构 286

（二）胰岛素“基因”的人工合成 287

（三）利用胰岛素原cDNA生产胰岛素 288

（四）细菌分泌胰岛素 288

二、干扰素 288

（一）人干扰素的结构与功能 288

（二）人干扰素αcDNA的克隆和表达 289

（三）人干扰素γ基因的高效表达 290

三、乙型肝炎病毒疫苗 291