基因打靶技术PDF电子书下载

1 基因打靶技术的发展简史及其应用前景 1

1.1 基因打靶技术的概念 1

1.2 胚胎干细胞技术的发展 2

1.3 同源重组技术的发展 3

1.4 基因打靶技术在生物医学研究中的应用前景 4

1.4.1 基因打靶技术在基因功能研究中的应用 4

1.4.2 应用基因打靶技术研制人类疾病动物模型 5

1.4.3 应用基因打靶技术改良动物品系和研制动物反应器 6

2 基因打靶的策略及载体设计 10

2.1 完全基因剔除 10

2.1.1 构建载体的一般原则 11

2.1.2 置换型载体 13

2.1.3 插入型载体 16

2.1.4 影响中靶效率的因素 18

2.1.5 体细胞打靶 21

2.2 基于 Cre-LoxP 重组酶系统的条件基因打靶 25

2.2.1 Cre-LoxP 重组酶系统 25

2.2.2 构建基因打靶载体要考虑的问题和 LoxP 的合理运用 27

2.2.3 条件基因打靶 30

2.2.4 表达 Cre 重组酶的转基因小鼠 34

2.3.1 “Hit and Run”法 44

2.3 用基因打靶技术引入精细突变 44

2.3.2 双置换法 46

2.3.3 “标记和置换”法 47

2.3.4 利用 Cre-LoxP 系统引入点突变 48

2.4 大片段染色体的重排和删除 50

2.4.1 放射线诱导的缺失突变 50

2.4.2 Cre-LoxP 介导的染色体重组 51

2.5 随机基因剔除——基因诱捕 57

2.5.1 诱捕载体的设计 58

2.5.2 基因诱捕载体导入 ES 细胞的方法 62

2.5.3 诱捕 ES 细胞的筛选和鉴定 63

2.5.4 基因诱捕研究的应用及其前景 65

2.6 ENU 诱导点突变与大规模基因突变和功能研究 69

2.6.1 ENU 诱变的机制 70

2.6.2 ENU 诱导的突变类型和诱变效率 71

2.6.3 ENU 剂量对不同小鼠品系的影响 71

2.6.4 ENU 诱导突变的策略 72

2.6.5 ENU 诱导突变表型的筛选 77

2.6.6 ENU 诱导点突变的鉴定 78

2.6.7 ENU 诱变研究的应用前景 79

2.7 利用基因敲入技术制备转基因动物 81

2.7.1 利用基因敲入技术制备转基因动物的策略 82

2.7.2 基因敲入法制备转基因动物的应用 85

2.7.3 结语 90

3 中靶胚胎干细胞的筛选 94

3.1 胚胎干细胞的分离和培养 95

3.1.1 ES 细胞的培养基 95

3.1.2 成纤维细胞用作 ES 细胞的饲养层细胞 96

3.1.3 小鼠 ES 细胞的分离 98

3.1.4 ES 细胞的鉴定 101

3.2 打靶载体转染 ES 细胞 103

3.2.1 电穿孔法转染 ES 细胞的条件 104

3.2.2 选择合适的抗性培养基 104

3.3 对发生同源重组的单克隆的筛选 105

3.3.1 阳性 ES 克隆的挑取 106

3.3.2 阳性 ES 克隆的冻存 107

3.3.3 ES 克隆基因组 DNA 的制备 107

3.3.4 PCR 法筛选中靶 ES 细胞 107

3.3.5 Southern 杂交法筛选中靶 ES 细胞 108

3.4 ES 细胞的体外诱导分化研究 109

3.4.1 ES 细胞体外诱导分化为肌细胞的研究 111

3.4.2 ES 细胞体外定向分化为神经元和神经胶质细胞 112

3.4.3 胚胎干细胞定向造血细胞分化的研究 115

4 由中靶细胞获得突变体动物的方法 126

4.1 通过囊胚显微注射法获得嵌合体小鼠 126

4.1.1 小鼠的饲养和管理 126

4.1.2 供体囊胚的制备 128

4.1.3 囊胚的显微注射 130

4.1.4 胚胎移植 132

4.1.5 嵌合体的鉴定和传代 134

4.1.6 基因打靶突变小鼠的维持 136

4.2 通过胚胎聚合法获得完全 ES 细胞来源的胚胎或嵌合体小鼠 138

4.2.2 聚合用胚胎的准备 139

4.2.1 用于胚胎聚合的 ES 细胞的准备 139

4.2.3 ES 细胞与胚胎的聚合 144

4.2.4 聚合体胚胎的培养和转移 147

4.2.5 剖腹产 147

4.2.6 二倍体或四倍体嵌合体胚胎的鉴定 147

4.2.7 完全 ES 细胞来源胚胎及嵌合体胚胎的应用和前景 148

5 基因打靶在现代生物学研究中的应用实例 153

5.1 应用基因剔除技术研究 Smads 基因的功能 153

5.1.1 SMADs 的结构及分类 154

5.1.2 SMADs 介导的信号转导 156

5.1.3 用基因剔除技术研究 Smads 基因在脊椎动物体内的功能 158

5.1.4 小结 162

5.2 葡萄糖激酶基因剔除及成年型糖尿病模型 165

5.2.1 MODY 的研究概况 165

5.2.2 葡萄糖激酶基因 166

5.2.3 MODY 的动物模型及葡萄糖激酶基因剔除 168

5.3 人类疾病的基因打靶小鼠模型 172

5.3.1 小鼠基因组学研究进展 172

5.3.2 小鼠模型的发展及特性 174

5.3.3 基因打靶小鼠作为人类疾病动物模型的研究 175

5.3.4 基因打靶小鼠作为人类疾病模型的问题与展望 182

5.4 核移植法研制突变体动物 184

5.4.1 生产突变体动物的传统方法 185

5.4.2 核移植方法的发展过程 186

5.4.3 影响核移植效率的因素及存在的问题 187

5.4.4 近期核移植的进展 188

5.4.5 基因打靶与核移植技术相结合的优势 190

5.4.6 基因打靶与核移植技术相结合的应用前景 191

6 基因打靶技术存在的问题及对策 195

6.1 打靶载体设计引起的问题 195

6.1.1 不完全剔除 195

6.1.2 其他基因编码区或者调控元件的删除 196

6.1.3 筛选标记基因对表型的影响 197

6.2 表型解释中存在的问题 198

6.2.1 基因冗余和代偿机制 198

6.2.2 遗传背景对小鼠表型的影响 200

6.2.3 修饰基因对表型的影响及应用 202

6.2.4 亚效等位基因 204

6.3 关于解决基因打靶研究中存在问题的建议 205

6.4 总结 206

7.1 靶基因 cDNA 探针的克隆 210

7 附录1 常用实验方法 210

7.2 靶基因基因组 DNA 片段的筛选和克隆 211

7.2.1 从小鼠基因组细菌人工染色体(BAC)文库中筛选基因组 DNA 片段 211

7.2.2 从小鼠基因组噬菌体文库中筛选基因组 DNA 片段 216

7.3 Northern 杂交分析 220

7.3.1 组织和细胞总 RNA 的提取 220

7.3.2 在含甲醛的凝胶上进行 RNA 电泳 220

7.3.3 将 RNA 转移至硝酸纤维素膜并进行杂交 221

7.3.4 采用 mRNA 膜进行 Northern 杂交 222

7.4 小鼠的基因型分析 222

7.4.1 从鼠尾提取基因组 DNA 222

7.4.2 采用 PCR 法鉴定小鼠的基因型 223

7.4.3 小鼠早期胚胎的基因型鉴定 224

7.5 常规组织学分析：苏木素-伊红染色 225

7.5.1 石蜡标本的包埋 225

7.5.2 石蜡切片 225

7.5.3 苏木素和伊红染色液的配制 225

7.5.4 常规石蜡切片苏木素-伊红(HE)染色程序 226

7.6 免疫组化分析 226

7.7 普通原位杂交 227

7.7.1 35S 标记的单链 RNA 探针的制备和纯化 227

7.7.2 组织切片的处理及原位杂交 228

7.7.3 漂洗和曝光 229

7.7.4 乳胶曝光和显影 230

7.8 整体原位杂交 230

7.8.1 地高辛(DIG)标记的 RNA 探针的制备 230

7.8.2 胚胎的固定 231

7.8.3 胚胎的预处理和杂交 231

7.8.4 漂洗和抗体标记 232

7.8.5 显色反应 232

7.9 小鼠的全骨架制备 233

7.11.1 组织切片的 lac Z 染色 234

7.11 小鼠组织的 lac Z 染色 234

7.10 利用藏红 O 染色检测小鼠骨切片中蛋白多糖的含量 234

7.11.2 整体胚胎的 lac Z 染色 235

8 附录2 常用溶液和缓冲液的配制 236

8.1 常用试剂的配制 236

8.2 杂交试验中用于降低背景的封闭液 241

8.3 蛋白水解酶类 242

8.4.2 M2溶液的配制 243

9 附录3 常用参考书和数据库 243

8.4.1 贮存液成分 243

8.4 M2和 M16溶液的配制 243

8.4.3 M16溶液的配制 244

9.2 常用基因打靶和转基因小鼠资源网站 245

9.2.1 主要数据库精选 245

9.2.2 遗传工程突变体小鼠 246

9.1 常用参考书 248

9.2.3 特定小鼠品系 248

9.2.4 ENU 诱变数据库 249

9.2.5 基因打靶操作手册 249

9.2.6 乳腺转基因数据库 250

9.2.7 商业和其他供应者 250

后记 251