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1.1 引言 1

1.2 缓冲液 1

1.2.1 缓冲液的性质 1

第一章 蛋白质分离的准备 1

1.2.2 缓冲液配制 4

1.2.3 浓度对缓冲液pH值的影响 5

1.2.4 某些缓冲液使用时的注意事项 6

1.2.5 防止缓冲液受污染 7

1.2.6 水的纯度 7

1.3 盐,金属离子和鳌合剂 7

1.3.1 离子强度 7

1.3.2 二阶阳离子 7

1.4.1 总则 8

1.4.2 特殊情况 8

1.3.3 鳌合剂 8

1.4 还原剂 8

1.5 去垢剂 9

1.5.1 去垢剂的分类 9

5.1.10 安全注意事项 10

1.5.2 蛋白质溶解的初始操作步骤 13

1.6 蛋白质的环境因素 14

1.6.1 表面效应 14

1.6.2 温度 14

1.6.3 储存 15

1.7 蛋白酶抑制剂 16

1.7.1 常用抑制剂 16

10.1 蛋白质纯化 18

1.7.2 蛋白酶抑制剂混合使用 18

2.1 引言 20

第二章 蛋白质的提取和溶解 20

2.2 细胞破碎和蛋白溶解 21

2.2.1 匀浆 21

2.2.2 超声 23

2.2.3 高压匀浆 25

2.2.4 研磨 25

2.2.5 (高速)珠磨 27

2.2.6 酶溶 27

2.2.7 化学渗透 28

2.2.8 其他方法 29

2.3 包涵体蛋白质的溶解 29

2.3.1 包涵体蛋白质的溶解及复性 30

2.3.2 防止包涵体形成 33

3.1 280纳米(A280)光吸收法 38

3.1.1 提要 38

第三章 蛋白质浓度测定 38

3.1.3 试剂 39

3.1.4 操作步骤 39

3.1.5 注意事项 39

3.1.2 设备 39

3.2 Bradford检测法 42

3.2.1 提要 42

3.2.2 设备 43

3.2.3 试剂 43

3.2.4 操作步骤 43

3.2.5 注意事项 46

3.3 Lowry检测法 47

3.3.1 提要 47

3.3.3 试剂 48

3.3.2 设备 48

3.3.4 操作步骤 49

3.3.5 注意事项 50

3.4 二喹啉甲酸(BCA)检测法 51

3.4.1 提要 51

3.4.2 设备 52

3.4.3 试剂 52

3.4.4 操作步骤 52

3.4.5 注意事项 54

3.5 斑点滤膜结合法 54

3.5.1 概述 54

3.5.2 操作步骤 54

3.6 干扰物质表 55

4.1 分析方法 60

4.1.1 二氯醋酸沉淀法 60

第四章 蛋白质溶液的浓缩 60

4.1.2 丙酮沉淀法 61

4.1.3 免疫沉淀法 62

4.2.1 硫酸铵沉淀法 65

4.2 制备方法 65

4.2.2 有机溶剂沉淀法 68

4.2.3 聚乙二醇沉淀法 69

4.2.4 超滤法 70

4.2.5 透析法 72

4.2.6 离子交换层析和冷浆干燥法简述 74

第五章 变性条件下的凝胶电泳 77

5.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 77

5.1.1 原理 77

5.1.3 制胶 79

5.1.2 设备 79

5.1.4 制备样品和上样 87

5.1.5 电泳 89

5.1.6 考马斯亮蓝染色 90

5.1.7 银染争 92

5.1.8 干胶 97

5.1.9 讨论 98

5.2.3 凝胶的制备 101

5.2.1 引言 101

5.2 梯度胶 101

5.2.2 仪器 101

5.3 SDS-尿素胶 103

5.3.1 引言 103

5.3.2 制胶 104

5.4.2 分子量的测定 105

5.4 其他方法 105

5.4.1 放射性标记样品的检测 105

5.4.3 蛋白质定量 107

5.4.4 电泳后蛋白的洗脱 108

第六章 非变性条件下的凝胶电泳 111

6.1 引言 111

6.2 不连续非变性凝胶电泳 112

6.2.1 设备 112

6.2.2 制胶 112

6.2.3 样品制备 117

6.2.4 电泳 118

6.2.5 凝胶染色 119

6.3.1 蛋白质分子量的测定 120

6.3 相关的方法 120

6.2.6 连续非变性凝胶电泳 120

6.3.2 电泳后酶活性的测定 122

第七章 等电聚焦和双向凝胶电泳 124

7.1 等电聚焦 124

7.1.1 原理 124

7.1.2 主要仪器 125

7.1.3 灌制等电聚焦凝胶 125

7.1.4 样品制备和上样 128

7.1.5 等电聚焦电泳 129

7.1.6 聚焦后处理 130

7.1.7 天然等电聚焦电泳的修正方案 130

7.1.8 讨论 131

7.2 固相pH梯度等电聚焦电泳 134

7.2.1 简介 134

7.2.2 仪器 135

7.2.3 制备等电聚焦凝胶 135

7.2.4 样品制备和上样 138

7.2.5 等电聚焦电泳 138

7.2.6 聚焦后处理 139

7.2.7 讨论 139

7.3 双向凝胶电泳 140

7.3.1 简介 140

7.3.2 仪器 140

7.3.3 操作步骤 141

7.3.4 讨论 144

第八章 蛋白质的毛细管电泳分析 148

8.1 引言 148

8.2 影响分离效率的几个因素 149

8.3.2 吸附涂层 151

8.3 柱制备技术 151

8.3.1 键合涂层 151

8.5 毛细管电泳检测器 152

8.4 不同分离条件的影响 152

8.6 实验操作 153

8.6.1 实验步骤 153

8.6.2 操作条件选择 153

8.6.3 毛细管区带电泳 155

8.6.4 毛细管等电聚焦 156

8.6.5 毛细管凝胶电泳 159

8.6.6 亲和毛细管电泳 160

8.7 应用实例 161

8.7.1 聚丙烯酰胶涂层毛细管电泳柱的制备 161

8.7.2 毛细管凝胶电泳分离蛋白质 162

8.7.3 毛细管等电聚焦 163

9.1 引言 166

第九章 免疫印迹 166

9.1.1 免疫印迹用膜 167

9.1.2 将蛋白质固定在膜上的其他应用 167

9.2 免疫印迹操作 168

9.2.1 仪器 168

9.2.2 试剂 168

9.2.3 操作步骤 169

9.2.4 其他检测方法的修正方案 178

9.2.5 总蛋白质染色 181

9.2.6 免疫印迹清除 182

9.3.2 转移异常 183

9.3.3 免疫印迹的其他应用 183

9.3.1 膜的储存 183

9.3 讨论 183

第十章 离子交换层析 189

10.1.1 引言 189

10.1.2 方法 197

10.2 蛋白质溶液的浓缩 210

10.3 批量层析 210

第十一章 凝胶过滤层析 212

11.1 蛋白质的纯化 212

11.1.1 引言 212

11.1.2 方法 219

11.2 更换蛋白质的缓冲液 229

第十二章 亲和层析 231

12.1 引言 231

12.2 亲和柱的制备 232

12.2.1 配基固相化技术 234

12.2.2 非特异洗脱的策略 236

12.3 特异分离技术 238

12.3.1 抗体 238

12.3.2 核酸 246

12.3.3 凝集素 250

12.3.4 染料配基 254

12.3.5 固相化金属亲和层析 257

12.3.6 疏水作用层析 259

第十三章 蛋白质的晶体培养——悬滴结晶 264

13.1 引言 264

13.2 悬滴结晶法 266

13.2.1 结晶原理 266

13.2.2 第一阶段操作步骤 269

13.3 设计最优结晶方案 278

13.3.1 稀溶液基质的微调 279

13.3.2 初始筛选的扩展 284

13.3.3 蛋白质结晶的灵活性与困难 284

第十四章 cDNA法推断蛋白质的一级结构 287

14.1 引言 287

14.2 一般策略 287

14.2.1 蛋白质的纯化和肽段氨基酸序列分析 287

14.2.2 引物的设计 289

14.2.3 用PCR扩增目的cDNA片段 291

14.2.4 cDNA的克隆及测序 292

14.2.5 cDNA序列的分析及蛋白质一级结构的确定 292

14.3 PK-120的纯化及肽段氨基酸序列分析 294

14.3.1 仪器及材料 294

14.3.2 PK-120的纯化 295

14.3.3 分离纯化肽段及测定氨基酸序列 296

14.4 部分分解多肽两端有关的PCR法筛选PK-120基因 297

14.4.1 仪器及材料 297

14.4.2 引物设计 298

14.4.3 PCR扩增 299

14.4.4 凝胶电泳及提取DNA 299

14.4.5 测定碱基序列 299

14.5 PK-120 cDNA克隆 300

14.5.1 仪器及材料 300

14.5.2 杂交反应 300

14.5.3 cDNA推测PK-120一级结构的特征 301

附录1 常用化学物质分子量 304

附录2 一些蛋白质的分子量和等电点 308

附录3 硫酸沉淀剂表 310

附录4 分光光度曲线 312