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第一章 细胞培养基本知识 1

1.1 前言 1

1.2 培养细胞的特性 5

1.2.1 培养细胞的生长方式及类型 5

1.2.1.1 贴附生长型细胞 5

1.2.1.2 悬浮生长型细胞 7

1.2.2 培养细胞的生长特点 7

1.2.2.1 贴附 7

1.2.2.2 接触抑制及密度依赖性 8

1.2.3 培养细胞的生长过程 9

1.2.3.1 单个细胞的生长过程 9

1.2.3.2 细胞系的生长过程 12

1.2.3.3 每代细胞的生长过程 15

1.3 培养细胞生长的条件 17

1.3.1 细胞的营养需要 17

1.3.1.1 基本营养物质 17

1.3.1.2 促生长因子等物质 18

1.3.2 细胞的生存环境 19

1.3.3 无污染及无毒 21

第二章 细胞培养室的设置、设备和准备工作 22

2.1 细胞培养实验室的设置及设备 22

2.1.1 细胞培养实验室的设置 22

2.1.1.1 无菌操作区 22

2.1.1.2 孵育区 25

2.1.1.3 制备区 25

2.1.1.4 储藏区 25

2.1.1.5 清洗和消毒灭菌区 25

2.1.2 细胞培养实验室的设备 25

2.1.2.1 常用的基本设备 25

2.1.2.2 特殊设备 30

2.2 培养用品的清洗和消毒灭菌 31

2.2.1 培养用品的清洗 31

2.2.2 培养用品的消毒灭菌 34

2.2.2.1 消毒灭菌的方法 34

2.2.2.2 消毒方法的选择 39

第三章 细胞培养用液及培养基（液） 40

3.1 培养用液 40

3.1.1 水 40

3.1.2 平衡盐溶液 41

3.1.3 消化液 42

3.2 培养基（液） 43

3.2.1 天然培养基 43

3.2.2 合成培养基（液） 46

3.2.2.1 合成培养基（液）基本成份 46

3.2.2.2 常用的合成培养基（液） 47

3.2.2.3 合成培养基（液）的配制 53

3.2.2.4 无血清培养基（液） 55

第四章 细胞培养的基本技术 58

4.1 基本操作技术和要求 58

4.1.1 培养室内的无菌操作 58

4.1.2 培养细胞的取材 60

4.1.2.1 取材的基本要求 60

4.1.2.2 取材的基本器材和用品 61

4.1.2.3 皮肤和粘膜的取材 61

4.1.2.4 内脏和实体瘤的取材 61

4.1.2.5 血细胞的取材 62

4.1.2.6 骨髓、羊水、胸水、腹水内细胞的取材 62

4.1.2.7 鼠胚组织的取材 62

4.1.2.8 鸡胚组织的取材 62

4.1.3 组织材料的分离 63

4.1.3.1 细胞悬液的分离方法 63

4.1.3.2 组织块的分离方法 63

4.1.3.2.1 机械分散法 63

4.1.3.2.2 剪切分离法 64

4.1.3.2.3 消化分离法 64

4.2 原代培养 68

4.2.1 组织块培养法 69

4.2.2 消化培养法 71

4.2.3 器官培养 72

4.3 传代培养和细胞系的维持 73

4.3.1 原代培养的首次传代 73

4.3.2 细胞传代方法 74

4.3.3 细胞系的维持 75

4.3.4 培养细胞的纯化 76

4.3.4.1 自然纯化 76

4.3.4.2 人工纯化 77

4.3.4.2.1 酶消化法 77

4.3.4.2.2 机械划除法 77

4.3.4.2.3 反复贴壁法 78

4.3.4.2.4 克隆法 78

4.3.4.2.5 培养基限定方法 79

4.3.4.2.6 流式细胞仪分离法 79

4.4 细胞冻存与复苏 79

4.4.1 细胞的冻存 79

4.4.2 细胞的复苏 82

4.4.3 培养细胞的运输 83

4.5 细胞培养污染的检测和排除 84

4.5.1 微生物污染的途径 84

4.5.2 微生物污染对细胞的影响 85

4.5.3 微生物污染的检测 85

4.5.4 微生物污染的防治 88

4.5.5 细胞交叉污染 88

第五章 正常组织细胞的培养 90

5.1 上皮细胞的培养 90

5.1.1 表皮 90

5.1.2 乳腺 93

5.1.3 子宫颈 95

5.1.4 肝 98

5.1.5 胰 100

5.1.6 肾 102

5.1.7 气管及支气管 102

5.1.8 前列腺 104

5.1.9 口腔粘膜上皮 105

5.2 中胚层细胞的培养 107

5.2.1 结缔组织细胞 107

5.2.2 脂肪组织细胞 107

5.2.3 肌肉组织细胞 107

5.2.4 软骨细胞 109

5.2.5 骨细胞 111

5.2.6 成骨细胞 111

5.2.6.1 骨组织块培养法 111

5.2.6.2 骨膜组织块培养法 112

5.2.6.3 酶消化培养法 112

5.2.6.4 骨髓培养法 114

5.2.6.5 成骨细胞的传代培养 115

5.2.6.6 培养的成骨细胞鉴定 115

5.2.7 破骨细胞 116

5.2.7.1 四肢长骨机械分离法 116

5.2.7.2 下蛋母鸡长骨分离法 117

5.2.7.3 颅盖骨消化法 117

5.2.7.4 骨髓单个核细胞培养法 118

5.2.7.5 培养的破骨细胞鉴定 119

5.2.8 内皮细胞 119

5.3 神经外胚层细胞的培养 121

5.3.1 神经原细胞 121

5.3.2 神经胶质细胞 122

5.3.3 黑色素细胞 123

5.4 血细胞的培养 125

第六章 肿瘤细胞的培养 127

6.1 肿瘤细胞的取材和培养 127

6.1.1 肿瘤细胞的取材方法 127

6.1.2 肿瘤细胞的培养方法及注意事项 128

6.2 培养肿瘤细胞的生物学鉴定 129

6.2.1 常用培养肿瘤细胞的生物学检查项目 129

6.2.2 人的恶性肿瘤细胞连续性细胞系（株）的建系（株）标准 130

6.3 抗癌药物敏感性试验 134

6.3.1 试验药物储备液的配制 134

6.3.2 受试细胞的准备 135

6.3.3 药物疗效的评价 135

6.3.4 药物敏感性试验 136

6.3.4.1 体外药物敏感试验 136

6.3.4.1.1 美蓝法 136

6.3.4.1.2 染料排斥试验法 136

6.3.4.1.3 生长曲线测定法 136

6.3.4.1.4 集落形成试验法 137

6.3.4.1.5 四唑盐（MTT）比色法 138

6.3.4.1.6 三磷酸腺苷生物发光法 138

6.3.4.1.7 放射性同位素掺入核苷酸前体物试验法 141

6.3.4.1.8 3H-亮氨酸掺入细胞蛋白质试验法 141

6.3.4.1.9 抗癌药的效能比测定法 141

6.3.4.2 体内抗癌药物敏感试验 142

6.3.4.2.1 裸鼠移植瘤试验 142

6.3.4.2.2 小鼠肾包膜下肿瘤移植试验 143

6.4 裸鼠移植瘤动物模型 144

6.5 肿瘤放射生物学实验模型 147

6.5.1 肿瘤放射生物学培养细胞实验模型 148

6.5.1.1 研究方法 148

6.5.1.1.1 单层培养细胞实验技术 148

6.5.1.1.1.1 细胞克隆（集落）计数法 148

6.5.1.1.1.2 四唑盐比色法（MTT法） 148

6.5.1.1.2 离体培养细胞的乏氧照射技术 149

6.5.1.1.3 离体多细胞球体实验技术 150

6.5.1.2 放射生物学中细胞存活曲线的数学模型 151

6.5.1.2.1 简单的多靶单击模型 151

6.5.1.2.2 带初斜率的多靶单击模型 152

6.5.1.2.3 线性平方模型 153

6.5.2 肿瘤放射生物学的实体瘤整体水平实验模型 153

6.5.2.1 肿瘤生长测定 155

6.5.2.2 50％肿瘤控制剂量（TCD50）测试 155

6.5.2.3 体内稀释分析技术 155

6.5.2.4 肺克隆测试 156

6.5.2.5 体内-体外分析技术 156

6.6 肿瘤侵袭模型 156

6.6.1 体内侵袭模型 156

6.6.1.1 皮下移植侵袭模型 157

6.6.1.2 肌肉内移植侵袭模型 157

6.6.1.3 腹腔内移植侵袭模型 157

6.6.1.4 小鼠肾包膜下移植侵袭模型 157

6.6.1.5 鼠睾丸包膜下移植侵袭模型 157

6.6.1.6 小鼠耳廓皮下移植侵袭模型 158

6.6.1.7 鼠爪垫皮下移植侵袭模型 158

6.6.1.8 视网内界膜侵袭模型 158

6.6.2 体外侵袭模型 158

6.2.2.1 体外静止器官培养法 158

6.2.2.1.1 半固体培养基单细胞器官培养法 158

6.2.2.1.2 液体培养基单细胞器官培养法 159

6.6.2.2 半体外半体内器官培养法 159

6.6.2.3 单层细胞器官培养法 160

6.6.2.4 瘤细胞球体器官培养法 161

6.6.2.4.1 静止球体器官培养法 161

6.6.2.4.2 旋转摇动球体器官培养法 161

6.6.2.5 单层细胞侵袭实验模型 162

6.7 肿瘤转移模型 162

6.8 肿瘤细胞分化诱导模型 164

6.8.1 体外分化诱导模型 164

6.8.1.1 白血病细胞分化诱导模型 164

6.8.1.2 实体瘤分化诱导模型 166

6.8.1.2.1 人粘液表皮样癌MEC-1细胞分化诱导实验 166

6.8.1.2.2 人肝癌Bel-7402细胞分化诱导实验 167

6.8.1.2 人结肠癌HT-29细胞分化诱导实验 167

6.8.1.2.4 人神经母细胞瘤LA-N-1细胞分化诱导实验 167

6.8.1.2.5 人黑色素瘤细胞分化诱导实验 167

6.8.2 体内分化诱导模型 167

第七章 培养细胞生长状况的观察 169

7.1 培养细胞的常规观察 169

7.2 活细胞的观察 171

7.2.1 培养细胞的相差显微镜观察 171

7.2.2 培养细胞的动态观察 173

7.3 细胞生长状况的观察 173

7.3.1 细胞计数 173

7.3.2 细胞生长曲线 175

7.3.3 细胞分裂指数 177

7.3.4 细胞贴壁率 179

7.3.5 细胞周期 179

第八章 细胞培养中的研究方法 181

8.1 细胞活力的检测方法 181

8.1.1 染料排除法 181

8.1.1.1 台盼蓝排斥试验 181

8.1.1.2 伊红Y排斥试验 182

8.1.1.3 苯胺黑排斥试验 182

8.1.2 克隆（集落）形成试验 183

8.1.2.1 平板克隆形成试验 183

8.1.2.2 软琼脂克隆形成试验 184

8.1.3 四唑盐（MTT）比色试验 186

8.1.4 三磷酸腺苷发光试验 187

8.1.5 细胞蛋白质含量测定法 188

8.1.6 细胞蛋白质合成测定法 189

8.2 细胞遗传学的检测方法 191

8.2.1 细胞DNA染色法 191

8.2.2 细胞DNA含量测定法 192

8.2.3 细胞DNA合成测定法 193

8.2.4 常用染色体显示法 194

8.2.5 染色体显带法 196

8.3 细胞形态学的研究方法 198

8.3.1 培养细胞的HE染色方法 198

8.3.2 培养细胞的免疫组织化学染色技术 200

8.3.2.1 免疫荧光染色方法 200

8.3.2.2 ABC免疫酶染色方法 202

8.3.2.3 注意事项 203

8.3.3 培养细胞嗜银蛋白（AgNORs）分析 204

8.3.4 培养细胞的电镜检测技术 206

8.3.4.1 培养细胞的透射电镜样品制备技术 206

8.3.4.2 培养细胞的扫描电镜样品制备技术 209

第九章 有关的部分实验技术 211

9.1 细胞的分离技术 211

9.1.1 梯度沉降分离法 211

9.1.2 等密度沉降分离法 213

9.1.3 流式细胞仪分离法 217

9.2 细胞器的分离技术 217

9.2.1 破碎细胞的方法 217

9.2.2 部分细胞器的分离方法 218

9.2.2.1 细胞核的分离 219

9.2.2.2 细胞膜的分离 221

9.2.2.3 线粒体及线粒体膜的分离 222

9.2.2.3.1 线粒体的分离 222

9.2.2.3.1 线粒体膜的分离 222

9.2.2.4 聚核糖体的分离 224

9.2.2.5 微粒体的分离 225

9.2.2.6 溶酶体的分离 226

9.3 细胞克隆技术 227

9.3.1 有限稀释法 227

9.3.2 平皿克隆分离法 229

9.3.3 软琼脂克隆分离法 230

9.3.4 单细胞显微操作法 230

9.4 杂交瘤技术 232

9.4.1 杂交瘤技术的基本原理 232

9.4.2 杂交瘤技术的主要用品 234

9.4.3 骨髓瘤突变缺陷细胞株的选择与传代培养 236

9.4.4 免疫脾细胞的制备 236

9.4.5 饲养细胞的制备 237

9.4.6 细胞融合实验 238

9.4.7 单克隆抗体的检测 239

9.4.8 克隆化培养 240

9.4.9 单克隆抗体的大量制备 241

9.4.10 杂交瘤细胞染色体的鉴定 241

9.4.11 单克隆抗体的鉴定 242

第十章 有关的部分分子生物学技术 243

10.1 基本分子生物学技术 243

10.1.1 培养细胞基因组DNA的提取 243

10.1.2 提取DNA鉴定 245

10.1.2.1 DNA纯度检测及含量计算 245

10.1.2.2 DNA分子量大小鉴定 246

10.1.3 培养细胞总RNA的提取 247

10.1.4 提取RNA鉴定 249

10.1.4.1 RNA纯度检测及含量计算 249

10.1.4.2 RNA分子量大小鉴定 249

10.1.5 DNASouthernBlot及杂交 250

10.1.5.1 洋品DNA内切酶水解 250

10.1.5.2 SouthernBlot及杂交 252

10.1.6 N0rthernBlot及杂交 255

10.1.7 WesternBlot及分析 256

10.2 培养细胞的原位杂交 258

10.2.1 载玻片和盖玻片预处理 259

10.2.2 组织细胞固定 260

10.2.3 探针制备 261

10.2.3.1 同位素DNA探针标记 261

10.2.3.1.1 随机引物延伸法 261

10.2.3.1.2 缺口平移标记法 263

10.2.3.1.3 体外RNA探针合成及标记 264

10.2.3.2 非同位素探针标记 267

10.2.3.2.1 核酸光敏生物素标记 267

10.2.3.2.2 DNA地高辛标记 268

10.2.4 原位杂交 269

10.2.4.1 同位素标记DNA探针的原位杂交 269

10.2.4.2 同位素标记RNA探针的原位杂交 271

10.2.4.3 地高辛标记的DNA探针原位杂交 272

10.2.5 洗涤 273

10.2.6 设计对照 274

10.3 细胞的基因转移 274

10.3.1 磷酸钙-DNA共沉淀法 276

10.3.2 DEAE—葡聚糖法 278

10.3.3 脂质体载体介导DNA转移 279

10.3.4 逆转录病毒载体介导DNA转染 281

10.3.4.1 可产生特异性逆转录病毒细胞系的建立 281

10.3.4.1.1 逆转录病毒载体进入包装细胞系 281

10.3.4.1.2 病毒滴度鉴定 283

10.3.4.2 原代培养正常上皮细胞的逆转录病毒转染 285

10.3.5 转染细胞鉴定 286

10.3.5.1 被转移DNA检测 287

10.3.5.2 免疫组织化学染色 287

10.3.5.3 软琼脂培养 287

10.3.5.4 转染细胞致瘤性检测 288

第十一章 有关的部分仪器分析技术 289

11.1 显微分光光度计 289

11.1.1 显微分光光度计的基本结构 289

11.1.2 显微分光光度术 290

11.1.2.1 基本原理 290

11.1.2.2 使用步骤 291

11.1.2.3 应用举例 293

11.1.3 显微荧光光度术 293

11.1.3.1 基本原理 293

11.1.3.2 使用步骤 294

11.1.3.3 应用举例 297

11.2 流式细胞仪 298

11.2.1 流式细胞仪的结构和原理 298

11.2.2 流式细胞仪的使用步骤 299

11.2.2.1 样品制备 299

11.2.2.1.1 制备单个细胞悬液 299

11.2.2.1.2 样品固定 300

11.2.2.2 样品染色和检测 300

11.2.2.2.1 活细胞荧光染色 300

11.2.2.2.2 DNA显示法 301

11.2.2.2.3 DNA和RNA双重染色 301

11.2.2.2.4 DNA与蛋白质双重染色 302

11.2.2.2.5 DNA与癌基因标本双标记测定 302

11.2.2.3 注意事项 303

11.2.3 应用举例 304

11.3 激光共焦细胞仪 305

11.3.1 激光共焦细胞仪的结构和原理 305

11.3.2 激光共焦细胞仪的使用步骤 307

11.3.3 应用举例 307

11.4 图像分析系统 309

11.4.1 图像分析系统的结构和原理 309

11.4.2 图像分析系统的使用步骤 310

11.4.3 应用举例 311

附录 312