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第一部分 基础微生物学实验技术 1

实验一 普通光学显微镜的结构与使用 1

实验二 培养基的配制与灭菌 4

实验三 微生物接种技术与细菌的接种和培养 7

实验四 细菌染色与形态观察 12

实验五 细菌的芽孢染色与观察 15

实验六 放线菌的接种与形态观察 15

实验七 酵母菌培养、水浸片制备与形态观察 16

实验八 酵母菌活体染色观察及死亡率的测定 18

实验九 酵母菌细胞大小及体积的测定 18

实验十 酵母菌细胞计数和出芽率的测定 20

实验十一 酵母菌子囊孢子的形成与观察 22

实验十二 霉菌培养与形态观察 23

实验十三 细菌的生理生化实验 25

实验十四 细菌菌落总数的测定 31

实验十五 大肠菌群的测定 33

实验十六 物理因素对微生物生长的影响 36

实验十七 化学因素对微生物生长的影响 37

实验十八 产蛋白酶的枯草芽孢杆菌的分离 38

实验十九 溶源性菌株的检查及噬菌斑的观察 39

实验二十 大肠杆菌半乳糖基因高频转导 40

实验二十一 紫外线诱变育种——绘制细胞存活率和突变率曲线 42

实验二十二 枯草杆菌营养缺陷型突变遗传标记的制作 44

实验二十三 大肠杆菌质粒DNA的快速提取及琼脂糖凝胶电泳 46

实验二十四 大肠杆菌的遗传转化 48

实验二十五 异宗接合型酵母菌的杂交实验 49

实验二十六 微生物菌种保藏实验 50

第二部分 应用微生物学实验技术 51

第一章 显微技术 51

第一节 暗视野显微镜的使用 51

实验1.1 暗视野显微镜使用举例——细菌运动的观察 52

第二节 相差显微镜的使用 52

实验1.2 相差显微镜使用举例——酿酒酵母细胞内部结构的观察 53

第三节 荧光显微镜的使用 54

第四节 电子显微镜的使用 55

实验1.3 荧光显微镜使用举例——抗酸细菌的观察 55

一、透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM） 56

二、扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope,SEM） 56

三、扫描透射电镜（Scanning Transmission Electron Microscope,STEM） 57

四、扫描隧道显微镜（Scanning Tunneling Microscope,STM） 58

实验1.4 电子显微镜的使用举例——电子显微镜样品的制备与观察 58

第五节 其它显微镜介绍 61

一、偏光显微镜 61

二、紫外光显微镜 61

三、激光扫描共聚焦显微镜 61

第二章 消毒、灭菌及除菌技术 62

六、电镜X射线微区分析技术 62

四、微分干涉差显微镜 62

五、多光子荧光显微镜 62

第一节 物理因素除菌的种类及方法 63

一、加热除菌 63

二、过滤除菌 67

三、辐射除菌 70

四、超声除菌 71

五、微波除菌 71

二、化学药物的灭菌原理 72

一、优良消毒剂和防腐剂的特点 72

第二节 化学药物的消毒与灭菌 72

六、低温等离子除菌 72

三、化学消毒剂的种类和应用形式 73

四、常用消毒剂的使用和灭菌原理 73

五、影响消毒剂作用的因素 77

六、消毒剂的使用原则 78

第三节 各类培养基常采用的灭菌方法及注意事项 78

一、各类培养基采用的灭菌方法 78

二、培养基灭菌的注意事项 78

二、氧化熏蒸 79

三、硫熏蒸 79

一、福尔马林加热熏蒸 79

第四节 无菌室和曲室的消毒与灭菌 79

第三章 微生物接种与培养技术 80

第一节 微生物的培养技术 80

一、好氧性微生物培养方法 80

二、厌氧微生物培养方法 81

实验3.1 丙酮丁醇梭状芽孢杆菌的厌氧培养 84

第二节 连续培养技术 86

第三节 同步培养技术 87

实验3.2 选择法获得同步生长酵母细胞的实验技术 88

第四节 透析培养技术 89

实验3.3 诱导法获得霉菌分生孢子同步生长的实验技术 89

实验3.4 乳酸杆菌与酵母菌的透析培养 91

第五节 高密度培养技术 91

实验3.5 产乳球菌素的乳酸乳球菌的膜过滤培养 92

第六节 原位分离培养技术 93

实验3.6 酿酒酵母酒精发酵的原位分离培养技术 94

第七节 补料分批培养技术 94

实验3.7 产杆菌肽地衣芽孢杆菌的补料分批培养 95

第八节 固体发酵技术 96

实验3.8 植酸酶的固体发酵 97

实验3.9 蕈菌的栽培技术举例——白灵菇的栽培 97

二、染料的种类及选择 99

一、染色的基本原理 99

第四章 染色技术及微生物细胞结构观察 99

第一节 染色技术 99

三、制片与染色 101

四、活体染色 101

实验4.1 酵母的负染色法 102

实验4.2 真菌的荧光染色与观察 103

实验4.3 细菌的抗酸性染色法 103

第二节 微生物细胞结构的观察 104

实验4.4 细菌细胞壁染色观察 104

实验4.5 细菌荚膜的染色与观察 105

实验4.6 细菌鞭毛的染色与观察 105

实验4.7 微生物细胞核的染色与观察 106

实验4.8 微生物细胞中异染粒的染色与观察 107

实验4.9 酵母细胞内脂肪粒的染色与观察 107

实验4.10 酵母细胞内肝糖粒的染色与观察 108

实验4.11 酵母细胞中液泡的活体染色与观察 108

实验4.12 酵母细胞线粒体的活体染色与观察 108

实验4.13 毛霉菌的琼脂槽培养法染色与观察 109

第五章 微生物生长控制 109

第一节 生物量测定 109

一、测生长量 109

二、计繁殖数 110

实验5.1 OD值法测定大肠杆菌肉汤培养基中的生长曲线 111

第二节 生长曲线测定 111

实验5.2 平板计数法测定酿酒酵母的生长曲线 112

实验5.3 菌丝重量法测定丝状真菌的生长曲线 114

实验5.4 核酸测定法绘制生长曲线 115

第三节 微生物生长代谢影响因素的测定 116

实验5.5 营养因素对微生物生长的影响 116

实验5.6 接种量对微生物生长的影响 117

实验5.7 种龄对微生物生长的影响 117

实验5.8 温度对微生物生长和代谢的影响 118

实验5.9 pH对微生物生长的影响 119

实验5.10 溶解氧对微生物生长的影响 120

实验5.11 表面活性剂对微生物生长和代谢的影响 121

第六章 微生物纯种分离技术 122

第一节 选择培养技术 122

一、分离样品的来源 122

二、培养条件的控制 122

第二节 纯种分离技术 123

一、简单平板分离法 123

二、稀释倾注分离法 123

三、毛细管分离法 124

四、小滴分离法 124

五、显微操纵单细胞分离技术 124

一、新种分离与筛选的方法步骤 125

第三节 菌种分离纯化的步骤 125

二、纯种的鉴定 126

第四节 细菌的分离 127

实验6.1 乳酸菌的分离 127

实验6.2 酸乳制品中乳酸菌的分离 128

实验6.3 分解脂肪的细菌的分离 128

实验6.4 水解淀粉的细菌的分离 129

实验6.5 醋酸菌的分离 130

实验6.6 己酸菌的分离 130

实验6.7 固氮菌的分离 131

实验6.8 嗜盐菌的分离 132

实验6.9 硝化细菌的分离测定 134

实验6.10 反硝化细菌的分离 135

实验6.11 谷氨酸产生菌的分离 136

实验6.12 甲烷代谢菌的分离 137

实验6.13 双歧杆菌的分离 140

第五节 放线菌的分离 144

实验6.14 弹土分离法分离金色链霉菌 144

实验6.15 诺卡氏菌的分离 145

实验6.16 稀有放线菌的分离 146

实验6.17 酒曲中酵母菌的分离 147

实验6.18 耐双乙酰啤酒酵母的分离 147

第六节 酵母的分离 147

实验6.19 耐二氧化硫葡萄酒酵母的分离 148

实验6.20 果汁中水解柠檬酸的酵母菌的分离 149

第七节 霉菌的分离 149

实验6.21 水解蛋白的毛霉的分离 149

实验6.22 根霉菌的分离 150

实验6.23 产糖化酶的黑曲霉的分离 150

实验6.24 产柠檬酸黑曲霉的分离 151

实验6.25 烈性噬菌体的分离 152

实验6.26 高效价噬菌体裂解液的制备 152

第八节 噬菌体的分离 152

实验6.27 枯草芽孢杆菌溶源性菌的检查 154

第七章 微生物生理生化试验 154

第一节 细菌的生理生化实验 155

实验7.1 β-半乳糖苷酶试验 155

实验7.2 含碳化合物的利用试验 155

实验7.3 丙二酸盐试验 155

实验7.4 葡萄糖铵试验 156

实验7.5 氰化钾试验 156

实验7.6 动力试验 157

实验7.7 血清学玻片凝集试验 157

实验7.9 耐盐性试验 158

实验7.8 溶血性试验 158

实验7.11 氨基酸脱羧酶试验 159

实验7.10 酪蛋白分解试验 159

实验7.12 尿素酶试验 160

实验7.13 氧化酶试验 160

实验7.14 细胞色素氧化酶试验 161

实验7.15 过氧化氢酶试验 161

实验7.16 TTC试验 161

实验7.18 苯丙氨酸脱氨酶试验 162

实验7.19 链激酶试验 162

实验7.17 卵磷脂酶试验 162

实验7.20 马尿酸钠水解试验 163

实验7.21 杆菌肽敏感试验 163

实验7.22 淀粉水解试验 164

实验7.23 精氨酸双水解酶的测定试验 164

第二节 放线菌的生理生化实验 165

实验7.24 放线菌的生理生化实验 165

第三节 酵母的生理生化实验 165

实验7.25 糖类发酵试验 165

实验7.26 碳源同化试验 166

实验7.28 分解杨梅苷的测定 167

实验7.29 类淀粉化合物形成的测定 167

实验7.27 氮源同化试验 167

实验7.30 产酯试验 168

实验7.31 分解脂肪试验 168

实验7.32 产酸测定 168

实验7.33 石蕊牛乳反应 169

实验7.34 明胶液化试验 169

实验7.35 尿素分解试验 169

实验7.36 啤酒酵母发酵力的测定 170

实验7.37 酵母菌热死温度的测定 171

实验7.39 酵母菌耐酒精能力的测定 172

实验7.40 酵母生孢子能力的测定 172

实验7.38 酵母菌凝集力的测定 172

实验7.41 霉菌产酸试验 173

第八章 微生物诱变育种实验 173

第一节 诱变育种中的几个问题 174

一、出发菌株的选择 174

二、细胞悬浮液的制备 174

三、诱变剂的选择及处理方法的选择 175

四、中间培养 178

五、突变型菌株的分离 178

第二节 突变型菌株的分离 183

实验8.1 抗反馈调节突变株赖氨酸高产菌株的筛选 183

实验8.2 抗生素效价的生物测定（管碟法） 184

实验8.3 耐高浓度自身代谢产物的抗反馈抑制突变型卡那霉素高产菌株的选育 186

实验8.4 大肠杆菌链霉素抗性标记的制作 187

实验8.5 酿酒酵母呼吸缺失突变株的选育 188

实验8.6 酱油曲霉温度敏感型突变株的选育 189

第九章 微生物细胞水平基因重组育种 190

第一节 细菌的转化 190

实验9.1 枯草杆菌质粒DNA的提取 192

实验9.2 地衣芽孢杆菌染色体DNA的提取 193

实验9.3 枯草杆菌染色体DNA的转化 194

实验9.4 枯草杆菌原生质体的转化 195

第二节 细菌的转导 196

实验9.5 枯草杆菌噬菌体的普遍转导 197

第三节 细菌的接合 198

实验9.6 大肠杆菌Hfr品系的建立 199

实验9.7 大肠杆菌的接合 200

第四节 酵母菌的杂交育种 202

一、酵母的生活史 202

二、酵母有性杂交技术 203

实验9.8 糖化酵母单倍体细胞分离与遗传标记制作 204

实验9.9 同宗接合型酵母株的杂交 206

实验9.10 应用多次回交法选育嗜杀清酒酵母株 207

第五节 霉菌的杂交育种 208

一、霉菌的准性生殖过程 208

二、霉菌的杂交育种 209

第六节 微生物细胞融合技术 210

实验9.11 细菌原生质体细胞融合 214

实验9.12 酵母菌原生质体细胞融合 215

实验9.13 利用核融合缺陷细胞融合法选育嗜杀葡萄酒酵母菌株 216

实验9.14 应用原生质体细胞融合技术选育酱油曲霉 220

实验9.15 电诱导酵母菌与短梗霉属属间融合 221

第十章 基因工程育种 222

第一节 概述 222

一、重组DNA中常用的工具酶 222

一、目的基因的获取 223

二、DNA分子的体外连接 223

第二节 基因工程基本操作步骤 223

二、载体－宿主系统 223

三、重组DNA导入宿主菌 224

四、重组克隆的筛选与鉴定 224

第三节 生物信息数据库与查询 225

一、概述 225

二、生物信息数据库与查询 225

实验10.1 酵母菌DNA的提取及检测 227

实验10.2 丝状真菌总RNA的提取及检测 229

实验10.3 PCR方法获得微生物的目的基因 230

实验10.4 RT-PCR获得真核生物的目的基因 232

实验10.5 利用标记的探针获得目的基因 234

实验10.6 体外基因重组及在大肠杆菌中的克隆 235

实验10.7 原核表达载体构建及在宿主中表达 238

实验10.8 真核表达载体构建及在宿主中表达 239

实验10.9 mRNA差别显示技术 241

实验10.10 微生物cDNA文库构建技术 244

实验10.11 PCR定点突变技术改造微生物菌种 247

实验10.12 丝状真菌的转化技术 248

第十一章 分子杂交技术 249

第一节 核酸探针的种类与标记方法 249

一、核酸探针的种类 249

二、核酸探针的标记和检测 250

实验11.1 用切口平移法标记双链DNA探针 252

实验11.2 随机引物延伸法进行纯化DNA片段的放射性标记 253

实验11.3 利用聚合酶链反应制备放射性标记的DNA探针 255

实验11.4 从RNA合成单链cDNA探针 256

第二节 核酸分子杂交类型 257

一、固相核酸分子杂交类型 257

二、液相核酸分子杂交类型 260

第三节 分子杂交基本操作步骤和杂交实验因素的优化 261

一、固相膜核酸分子杂交方法 261

二、核酸分子杂交实验因素的优化 261

实验11.5 Southern杂交实验 263

实验11.6 Northern杂交实验 265

第十二章 微生物免疫及现代检测技术 269

第一节 抗体的制备 269

实验12.1 乳化抗原的制备 270

实验12.2 抗血清的制备 271

实验12.3 杂交瘤与单克隆抗体的制备 273

第二节 抗体的纯化 277

实验12.4 抗血清中IgG的分离与纯化 277

第三节 凝集反应试验方法 278

实验12.5 玻片凝集反应试验 278

实验12.6 单向琼脂扩散试验 279

第四节 沉淀反应检测方法 279

第五节 酶联免疫吸附技术 280

实验12.7 夹心ELISA测定乙型肝炎表面抗原的实验 281

第六节 免疫胶体金技术 283

实验12.8 免疫金银染色法 283

第七节 免疫印迹 285

实验12.9 免疫印迹 285

第十三章 微生物分类技术 288

实验13.1 热变性温度法测定GC含量 288

实验13.2 原核微生物16S rRNA基因的分离及序列分析 289

实验13.3 真核微生物18S rRNA基因的分离及序列分析 291

实验13.4 DNA杂合法在分类中的应用 292

实验13.5 细胞壁成分分析在分类中的应用 293

实验13.6 红外吸收光谱法在微生物分类中的应用 294

实验13.7 利用微生物快速测定仪对微生物进行分类 295

第十四章 食品卫生微生物学检测 296

第一节 总则 296

一、采样用具 296

二、样品的采集 296

三、送检 299

四、检验 299

第二节 各类微生物检验法 299

实验14.1 沙门氏菌属（Salmonella）的检验 300

实验14.2 志贺氏菌属（Shigella）的检验 309

实验14.3 致泻大肠埃希氏菌（Diarrheogenic Escherichia coli）的检验 312

实验14.4 副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的检验 315

实验14.5 小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）的检验 318

实验14.6 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的检验 320

实验14.7 溶血性链球菌（Streptococcus hemolyticus）的检验 321

实验14.8 肉毒梭菌（Clostridium borulinum）及肉毒毒素的检验 323

实验14.9 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的检验 325

实验14.10 霉菌和酵母的计数 328

实验14.11 水的细菌学检验 330

实验14.11(1) 水中细菌总数的测定 330

第三节 食品加工和发酵生产环境的卫生学检验 330

实验14.11(2) 多管发酵法测定水中大肠菌群 331

实验14.11(3) 滤膜法测定水中大肠菌群 335

实验14.12 空气中的微生物检测 336

第十五章 微生物菌种保藏 338

第一节 普通菌种保藏方法 338

一、定期移植保藏法 338

二、沙管保藏法 339

三、液体石蜡保藏法 340

四、液氮保藏法 341

五、冷冻真空干燥保藏法 342

第二节 特殊菌种保藏方法 344

一、噬菌体的保藏法 344

六、悬液保藏法 344

八、孢子滤纸保藏法 344

七、木粒麸皮保藏法 344

二、厌氧性细菌的保藏法 345

附录 348

Ⅰ．染色液及其配制 348

Ⅱ．培养基 349

Ⅲ．生理生化实验培养基及试剂 355

Ⅳ．食品卫生微生物学检测用培养基、试剂及染色液 359

主要参考书目 365