实用RNAi技术 线虫、果蝇和哺乳动物细胞基因沉默的基本原则与方法PDF电子书下载

1　RNAi:2002年的重大突破 1

1.1 RNAi：功能基因组学研究的工具 2

1.2 RNAi的作用机制 3

1.3 Dicer：裂解dsRNA的启动器？ 3

1.4 miRNA与siRNA：参与RNAi的两类小RNA 6

1.5 RNA诱导的沉默复合体（RISC）：沉默mRNA的效应器？ 8

1.6 RNA依赖的RNA多聚酶（RdRp）在RNAi作用中的地位 12

1.7 RNAi在基因表达调控中的作用 13

1.8　哺乳动物中的RNAi 14

1.9　应用 16

参考文献 17

2　线虫的RNAi 23

2.1　引言 23

2.2　RNAi在线虫中的应用 26

2.3　靶向序列的评价 26

2.4　dsRNA的合成 27

2.4.1.2　通过PCR/RT-PCR制备DNA模板 28

2.4.1　DNA模板的制备 28

2.4.1.1　质粒模板 28

2.4.2　体外转录获取dsRNA 31

2.5　dsRNA的导入 34

2.5.1 线虫的解剖学知识 35

2.5.2　用于基因沉默的线虫 36

2.5.3 线虫培养 38

2.5.4　微注射法 38

2.5.5　浸泡法 39

2.5.6　喂饲法 40

2.5.7 喂饲大肠杆菌表达dsRNA所用的DNA模板 42

2.5.8　用于表达发夹RNA的DNA模板 43

2.5.8.1　线虫启动子 44

2.5.8.2　构建反向重复序列载体 44

2.6　线虫显微镜计数 49

2.7　基因组筛选 52

2.8　线虫研究的相关文献 53

参考文献 54

2.9　相关网站 54

3　果蝇的RNAi 58

3.1　引言 58

3.2　RNAi在果蝇中的应用 60

3.2.1　用线性DNA模板制备dsRNA 61

3.2.2 用反向重复DNA序列制备dsRNA 62

3.2.3　在果蝇细胞株中诱导表达dsRNA 67

3.2.4 局限性 67

3.3.1　体外转录合成dsRNA 68

3.3　合成dsRNA 68

3.3.2　反向重复DNA 72

3.4　注射 78

3.4.1　注射服务 78

3.4.2　注射方法 78

3.4.3　准备dsRNA或反向重复DNA序列 79

3.4.4　胚胎收集 79

3.5　细胞系 82

3.6.1　S2细胞的复苏和培养 84

3.6　细胞培养 84

3.6.2　S2细胞的冻存 85

3.7　S2细胞的RNAi 86

3.7.1 磷酸钙法转染dsRNA 87

3.7.2 浸泡法导入dsRNA 87

3.8　高通量筛选 88

3.9　相关网址 90

3.10　果蝇研究的相关书籍和文献 90

参考文献 91

4.1　引言 95

4　哺乳动物的RNAi 95

4.2　细胞培养中的瞬时RNAi 96

4.2.1　siRNA的化学合成与修饰 96

4.2.1.1　优点 100

4.2.1.2　局限性 100

4.2.2 合成siRNA寡核苷酸 101

4.2.3 siRNA设计原则 101

4.2.3.1　siRNA序列的偏倚和脱靶 101

4.2.3.2　提高siRNA的稳定性 102

4.2.3.3　siRNA设计：新的“Tusehl”法则 104

4.2.3.4　BLAST、FASTA或Smith-Waterman算法 107

4.2.3.5　问题解决 108

4.2.3.6　siRNA设计程序和算法 108

4.2.3.7　准备siRNA双链体 110

4.2.4 酶促合成siRNA 110

4.2.4.1　DNA寡核苷酸的设计 111

4.2.4.2　体外dsRNA转录 113

4.2.5 长片段dsRNA加工 118

4.2.5.1　在Hi5昆虫细胞株中表达Dicer 119

4.2.5.2　重组Dicer消化dsRNA 122

4.2.5.3　大肠杆菌重组RNaseⅢ的制备 123

4.3　siRNA导入细胞 126

4.3.1 转染 127

4.3.2 电穿孔 128

4.3.3 用细胞穿透肽（CPP）运载siRNA 130

4.3.4 CPP或蛋白质转导结构域（PTD） 130

4.3.4.1　siRNA与CPP耦联 132

4.3.4.3　酶促合成5′-巯基修饰的siRNA 135

4.3.4.2　化学合成5′-疏基修饰的siRNA 135

4.3.4.4　半胱氨酸修饰的CPP与siRNA耦联 138

4.3.4.5　用肽-siRNA处理细胞 140

4.4　siRNA分析 142

4.4.1 siRNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 142

4.4.2　琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定dsRNA和siRNA 146

4.4.2.1　dsRNA和siRNA双链体的检测 146

4.4.2.2　同时检测siRNA和mRNA 146

4.5 短发卡RNA（shRNA）的RNAi作用 147

4.5.1 shRNA表达载体 149

4.5.1.1　茎环结构 151

4.5.1.2　干扰素样反应 152

4.5.1.3　优点 152

4.5.1.4　局限性 153

4.5.1.5　方法 153

4.5.2 慢病毒介导的RNAi 155

4.5.2.1　导入问题 155

4.5.2.2　局限性 157

4.5.2.3　克隆RNAi表达框 159

4.5.2.4　克隆策略 161

4.6 长发夹RNA（lhRNA）的RNAi作用 172

4.6.1 来源于反向重复DNA序列的lhRNA 173

4.6.1.1　反向重复DNA序列 174

4.6.1.2　高通量方法分离反向重复DNA序列 178

4.6.2 用正向重复DNA序列表达lhRNA 181

4.6.3　缺失5′-端帽子和多聚腺苷酸（A）尾的反向重复序列 183

4.6.4　RNAi与dsRNA脱氨基 186

4.7　检测干扰素样反应 188

4.7.1 RT-PCR半定量法分析2′-5′-OAS活性 190

4.7.2　DNA片段分析 191

4.7.3 PKR活性和eIF2α磷酸化分析 191

4.8　在哺乳动物细胞中诱导持续性的RNAi 194

4.9　RNAi在小鼠中的应用 198

4.9.1　高压尾静脉注射 198

4.9.2　体内电穿孔 199

4.9.5 原核注射建立转基因小鼠 201

4.9.3　腺病毒感染成年小鼠 201

4.9.4 慢病毒感染建立转基因小鼠 201

4.10　备选方法：核酶裂解法制备dsRNA 204

4.11　高通量筛选 205

4.11.1 条形码shRNA文库构建 205

4.11.2 酶修复全基因组shRNA文库 207

4.11.3 全基因组siRNA筛选 210

4.11.4 RNAi芯片 211

4.12.1 学术资源 212

4.12　有用的网页及链接 212

4.12.2　公司资源 213

4.12.3　其他链接 213

参考文献 214

附录 225

附录1　英文简称与中英文全名对照 225

附录2　实验方法目录 235

附录3　RNAi相关化学试剂和探针供应商 237

附录4　名词解释 239