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第一章 基因与基因工程 1

一、基因研究的发展 1

1.基因学说的创立 1

2.基因与DNA分子 3

3.基因与DNA的多核苷酸区段 5

4.基因与多肽链 6

5.基因的碱基顺序与蛋白质的氨基酸顺序 7

6.基因的表达与调控 10

7.基因的分离 11

8.基因的合成 14

二、基因的现代概念 15

1.移动基因 15

2.断裂基因 17

3.重叠基因 19

4.假基因 20

5.重复序列及重复基因 22

三、基因工程的诞生及其主要的研究内容 24

1.基因工程的诞生 24

2.基因工程的定义及其主要的研究内容 28

四、有关基因工程安全性的争论 29

第二章 基因操作的基本技术 34

一、凝胶电泳 34

二、核酸分子杂交 36

1.萨瑟恩DNA吸印杂交技术 37

2.诺塞恩RNA吸印杂交技术 38

3.菌落（或噬菌斑）杂交技术 40

三、细菌转化 41

四、DNA核苷酸序列分析技术 43

1.Sanger 双脱氧链终止法 44

（1） Sanger双脱氧链终止法的基本原理 44

（2） Sanger 双脱氧-M13体系DNA序列分析法 45

（3） Sanger 双脱氧-pUC体系DNA序列分析法 48

2.Maxam-Gilbert化学修饰法 51

（1） Maxam-Gilbert化学修饰法的基本原理 51

（2）碱基特异的化学切割反应 51

（3） Maxam-Gilbert化学修饰-CS载体系统DNA序列分析法 54

（4） Maxam-Gilbert化学修饰法的优点 54

3.DNA序列分析法的自动化 55

五、基因的化学合成 56

1.基因化学合成的概况 56

2.磷酸二酯法合成寡核苷酸 57

3.磷酸三酯法合成寡核苷酸 59

4.固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸 60

5.用寡核苷酸片段组装基因的方式 61

6.寡核苷酸化学合成的实际用途 62

（1）作为合成基因的元件 63

（2）作为核苷酸序列分析的引物 63

（3）作为核酸分子杂交的探针 63

（4）用于定点突变研究 64

六、寡核苷酸诱发的基因定点突变 64

1.寡核苷酸诱发基因定点突变的原理 64

2.寡核苷酸诱发基因定点突变的过程 65

（1）正链DNA的合成 65

（2）突变引物的合成 65

（3）异源双链DNA分子的制备 65

（4）闭环异源双链DNA分子的富集 65

（5）转化 65

（6）突变体的筛选 66

（7）突变基因的鉴定 67

第三章 基因克隆的酶学基础 68

一、核酸内切限制酶与DNA分子的体外切割 68

1.寄主控制的限制与修饰现象 68

2.核酸内切限制酶的类型 70

3.Ⅱ型核酸内切限制酶的基本特性 74

4.核酸内切限制酶的命名法 78

5.影响核酸内切限制酶活性的因素 79

（1） DNA的纯度 79

（2） DNA的甲基化程度 79

（3）酶切消化反应的温度 80

（4） DNA的分子结构 80

（5）核酸内切限制酶的缓冲液 81

二、DNA连接酶与DNA分子的体外连接 81

1.DNA连接酶 81

2.粘性末端DNA片段的连接 84

3.平末端DNA片段的连接 86

4.用化学合成的衔接物连接DNA分子 87

三、DNA聚合酶 91

1.DNA聚合酶Ⅰ与核酸杂交探针的制备 91

（1）DNA聚合酶Ⅰ 91

（2） DNA缺口转移 93

（3） DNA杂交探针的制备 95

2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段与DNA末端标记 95

3.T4 DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片段 96

4.依赖于RNA的DNA聚合酶与互补DNA的合成 98

5.T7 DNA聚合酶 99

6.修饰的T7 DNA聚合酶 100

四、DNA及RNA的修饰酶 101

1.末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾 101

2.T4多核苷酸激酶与DNA分子5′-末端的标记 103

3.碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用 104

五、核酸外切酶 106

1.核酸外切酶Ⅶ （exoⅦ） 106

2.核酸外切酶Ⅲ （exoⅢ） 106

3.λ核酸外切酶（λexo）和T7基因6核酸外切酶 108

六、单链核酸内切酶 109

1.λ核酸酶与RNA分子定位 109

2.Bal31核酸酶与限制位点的确定 111

第四章 基因克隆的质粒载体 113

一、质粒的一般生物学特性 113

1.质粒DNA 113

2.质粒DNA的转移 114

3.质粒DNA的迁移作用 117

4.质粒DNA的复制类型 119

5.质粒的不亲和性 120

二、质粒DNA的复制与拷贝数的控制 121

1.质粒DNA复制的多样性 121

2.多拷贝质粒ColEI DNA复制的一般特性 121

3.质粒DNA拷贝数的控制 122

4.杂种质粒DNA拷贝数的控制 124

三、质粒载体的选择 125

1.用作克隆载体的质粒必须具备的基本条件 125

2.载体类型的选择 126

（1）高拷贝数质粒载体的选用 126

（2）低拷贝数质粒载体的选用 127

（3）插入失活型质粒载体的选用 127

3.质粒载体的选择记号 128

四、大肠杆菌质粒载体 129

1.pSC101质粒载体 129

（1）应用pSC101质粒作基因克隆载体的实例Ⅰ——葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的表达 131

（2）应用pSC101质粒作基因克隆载体的实例Ⅱ——在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾DNA 133

2.ColEI质粒载体 133

3.pBR322质粒载体 134

（1） pBR322质粒载体的构建 134

（2） pBR322质粒DNA分子的结构特点 137

（3） pBR322质粒的改良 139

（4）应用pBR 322质粒作为基因克隆载体的实例——水稻叶绿体光诱导基因psbA的结构分析 141

4.其它的大肠杆菌质粒载体 142

（1）低拷贝数的质粒载体 142

（2）直接选择的质粒载体 143

（3）失控的质粒载体 145

第五章 噬菌体载体和柯斯载体 146

一、噬菌体的一般生物学特性 146

1.噬菌体的结构及其核酸类型 146

2.噬菌体的感染性 147

3.噬菌体的溶菌生命周期 148

4.噬菌体的溶源生命周期 149

5.重组体噬菌体的分离 153

二、λ噬菌体载体 154

1.λ噬菌体分子生物学概述 155

2.λ噬菌体载体的构建 159

（1）多余限制位点的消除——λ噬菌体改建的基本原理 159

（2）插入型载体 162

A.免疫功能失活的插入型载体 162

B.β-半乳糖苷酶失活的插入型载体 162

（3）替换型载体 163

（4） Spi-正选择的替换型载体 164

3.λ重组体DNA分子的体外包装 167

（1） λ重组体DNA分子的转染作用 167

（2） λDNA的体外包装 168

（3） λ噬菌体DNA的包装限制问题 170

4.重组噬菌体的成熟 171

5.克隆在λ噬菌体载体上的外源基因的表达 171

三、凯伦噬菌体载体 173

四、柯斯质粒载体 174

1.柯斯质粒载体的构建 174

2.柯斯质粒载体的特点 175

3.柯斯克隆 175

五、单链DNA噬菌体载体 180

1.M13噬菌体的生物学特性 180

2.M13克隆体系 182

3.M13载体系列的发展 183

4.M13载体系列的优点 187

第六章 基因的分离与鉴定 190

一、DNA克隆片段的产生与分离 190

1.基因组DNA的片段化 190

2.DNA片段的大小分部 192

3.编码目的基因的克隆片段的富集 193

二、重组体DNA分子的构建 193

1.载体DNA的分离 194

2.含有目的基因的外源DNA片段同载体分子的重组 196

（1）外源DNA片段定向插入载体分子 196

（2）非互补粘性末端DNA分子的连接 197

（3）最佳连接反应 199

三、重组体分子导入受体细胞 201

1.重组体DNA分子的转化或转染 201

2.体外包装的λ噬菌体之转导 202

四、基因克隆的实验方案 203

1.互补作用克隆 206

2.cDNA基因文库 207

（1）不同丰度mRNA的cDNA克隆 207

A.高丰度mRNA的cDNA克隆 207

B.低丰度mRNA的cDNA克隆 209

C.稀少mRNA的cDNA克隆 209

（2） cDNA克隆的优越性 210

3.基因组DNA克隆 212

（1）用λ噬菌体载体构建基因组DNA基因文库 212

（2）利用柯斯质粒作载体构建基因组DNA基因文库 214

五、重组体分子的选择与鉴定 216

1.遗传检测法 216

（1）根据载体提供的表型特征选择重组体分子的直接选择法 216

A.抗药性记号插入失活选择法 216

B.β-半乳糖苷酶显色反应选择法 219

（2）根据插入序列提供的表型特征选择重组体分子的直接选择法 221

2.物理检测法 222

（1）凝胶电泳检测法 223

（2） R-环检测法 223

3.核酸杂交检测法 223

4.免疫化学检测法 225

（1）放射性抗体检测法 226

（2）免疫沉淀检测法 228

（3）表达载体产物之免疫化学检测法 229

5.转译筛选法 231

（1）杂交抑制的转译 231

（2）杂交选择的转译 231

6.正负筛选法 232

第七章 真核基因在大肠杆菌中的表达 234

一、引言 234

二、基因表达的基本问题 236

1.转录 236

（1） RNA合成的化学特性 236

（2） RNA合成的不同阶段 237

（3）RNA分子的类型 240

（4）真核生物的转录 242

2.转译 244

（1）转译的概述 244

（2）转译的三个步骤 246

三、真核基因在大肠杆菌细胞中的表达 250

1.理论问题 250

2.克隆基因表达的基本条件 251

3.增强外源蛋白质稳定性的途径 252

4.克隆基因表达的检测 254

四、原核生物的表达载体 256

1.lac启动子的表达载体 256

2.trp启动子的表达载体 259

3.PL启动子的表达载体 261

五、高等真核基因在大肠杆菌中表达的实例 263

1.合成的脑激素基因在大肠杆菌细胞中的表达 263

2.胰岛素基因在大肠杆菌细胞中的表达 266

六、提高克隆基因表达水平的途径 270

1.启动子结构对表达效率的影响 270

2.转译起始序列对表达效率的影响 270

3.启动子同克隆基因间隔距离对表达效率的影响 271

4.质粒拷贝数对表达效率的影响 275

5.转录终止区对克隆基因表达效率的影响 275

6.质粒分离的不稳定性对克隆基因表达效率的影响 276

7.质粒稳定性对克隆基因表达效率的影响 276

第八章 植物基因工程 278

一、引 言 278

二、植物基因工程的主要研究方向 279

1.提高光合作用效率的植物基因工程基础研究 279

（1）光合作用概述 279

（2）光合作用基因工程的主要目标 280

（3）叶绿体基因结构与功能的研究是开展光合作用基因工程的重要基础 281

2.生物固氮与固氮基因的转移 282

（1）根瘤菌的固氮作用 282

（2）固氮酶复合体 284

（3）生物固氮的基因工程 284

3.增加种子的营养价值 285

4.提高农作物抗病虫害及除草剂的能力 287

（1）培育抗病虫害的农作物 287

（2）培育抗除草剂的农作物 288

5.增加植物次生代谢产物的产率 288

三、植物基因转移的病毒载体 289

1.单链RNA植物病毒 289

2.单链DNA植物病毒 291

3.双链DNA植物病毒 292

（1）花椰菜花叶病毒组的一般生物学特性 293

（2） CaMV DNA的特性 293

（3） CaMV DNA核酸内切限制酶切割图谱 294

（4） CaMV的生活史模式 297

4.花椰菜花叶病毒DNA载体 297

（1） CaMV DNA的表达 297

（2） DNA的缺失或插入与CaMV的感染性 298

（3） CaMV克隆载体的发展 299

A.互补载体系统 299

B.混合载体系统 299

C.CaMV 35S启动子融合基因载体系统 300

（4） CaMV DNA作为克隆载体的评价 300

四、植物基因转移的质粒载体 301

1.病原土壤杆菌 301

2.植物冠瘿的诱发与冠瘿细胞的特性 303

3.Ti质粒的遗传特性 306

（1）冠瘿瘤诱发之遗传本质 306

（2） Ti质粒的遗传功能 307

（3）以Ti质粒为媒介的接合转移 307

（4） Ti质粒的限制图及基因图 308

4.T-DNA的结构与功能 309

（1） Ti质粒与T-DNA 309

（2） T-DNA的整合机理 309

（3） T-DNA的结构与功能 310

5.Ti质粒载体的构建 311

（1） T-DNA转化的选择记号 311

（2）共合载体法 312

（3） 双元载体系统 314

A.双元Ti载体系统 314

B.无T-DNA的双元系统 316

（4）隔端载体法 317

6.Ri质粒载体系统 319

五、培育转基因植物的实验方法 319

1.根瘤土壤杆菌的转化 319

（1）两步接合转移法 320

（2）三亲株杂交转移法 320

2.植物细胞的转化 321

（1）创伤植株感染法 321

（2）原生质体共培养法转化植物细胞 323

（3）叶盘法转化植物细胞 324

（4）土壤杆菌对单子叶植物的感染问题 325

第九章 哺乳动物基因工程 327

一、哺乳动物基因转移的遗传选择标记 327

1.嘌呤和嘧啶的生物合成 327

2.胸苷激酶基因选择系统 327

（1） tk-细胞 327

（2） HAT选择法 328

（3）共转化选择 329

3.二氢叶酸还原酶基因选择系统 329

（1）基本原理 329

（2）显性选择 330

4.氯霉素乙酰转移酶基因选择系统 331

（1） CAT质粒 331

（2） CAT酶活性的测定 331

5.黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因选择系统 332

6.氨基糖苷磷酸转移酶基因选择系统 333

二、外源DNA导入哺乳动物细胞的方法 334

1.磷酸钙转染技术 334

（1）磷酸钙转染的基本步骤 334

（2）影响磷酸钙转染效率的因素 334

2.DEAE-葡聚糖转染技术 336

（1） DEAE-葡聚糖转染的一般程序 336

（2）DEAE-葡聚糖转染的可能机理及影响因素 336

（3） DEAE-葡聚糖转染法的评价 336

3.聚阳离子-DMSO转染技术 337

4.基因显微注射技术 337

（1）显微注射法 337

（2）穿刺法 338

5.电穿孔DNA转染技术 338

（1）基本原理 338

（2）操作程序 338

（3）影响因素 339

6.脂质体载体法 339

三、SV40病毒载体 340

1.SV40病毒的基本生物学特性 340

（1） SV40病毒的生活周期 340

（2） SV40病毒的基础分子生物学 341

2.SV40病毒载体的发展 342

（1）取代型重组病毒载体 343

A.晚期区段取代载体 343

①在猿猴细胞中表达大鼠前胰岛素基因的晚期区段取代载体 343

②在猴肾细胞中表达兔β-珠蛋白基因的晚期区段取代载体 343

B.早期区段取代载体 345

（2）重组的病毒-质粒载体 346

A.含有完整早期区段和复制起点的病毒-质粒载体 346

B.微型病毒复制子-质粒载体 347

四、反转录病毒载体 347

1.反转录病毒的一般生物学特性 347

（1）生活周期 348

（2）反转录病毒基因组的特点 348

（3）反转录病毒的复制 349

（4）原病毒DNA的表达 349

A.原病毒DNA的结构特点 349

B.原病毒DNA的转录与转译 351

C.原病毒DNA的表达与肿瘤的诱发 352

2.反转录病毒载体的主要类型 352

（1）辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒载体 352

（2）不需要辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒载体 353

（3）广寄主的反转录病毒载体 354

（4）反转录病毒表达载体 354

A.反转录病毒表达载体的构建 355

B.影响表达效率的因素 355

五、其它的病毒载体 356

1.痘苗病毒载体 356

（1）痘苗病毒的特性 356

（2）痘苗病毒载体的构建 356

2.乳头状瘤病毒载体 357

（1）牛乳头状瘤病毒基因组的结构特点 357

（2）牛乳头状瘤病毒载体 353

A.简单的载体 358

B.穿梭载体 358

3.腺病毒载体 359

（1）腺病毒的一般生物学特性 359

（2） 腺病毒载体的构建 360

第十章 重组DNA技术的应用 361

一、重组DNA技术与医学研究 361

1.癌症研究 361

（1）致癌基因 361

（2）细胞癌化 363

A.蛋白质激酶 363

B.ras族致癌基因 363

C.myc族致癌基因 364

2.爱滋病研究 364

（1） HIV基因组结构 366

（2） HIV病毒的生命周期 366

（3）爱滋病的预防与治疗 366

3.基因治疗 367

（1）基因治疗的主要目标 367

（2）使用反转录病毒载体进行基因治疗 368

（3）哺乳动物细胞基因点射 368

4.重组DNA探针与遗传病诊断 370

（1）遗传性疾病的产前诊断 370

（2）胎儿的DNA分析 370

二、重组DNA技术与疫苗生产 371

1.疫苗的设计 372

2.重组亚基疫苗 372

（1）抗乙型肝炎病毒（HB V）的重组亚基疫苗 372

（2）抗其它病毒的重组亚基疫苗 374

3.重组病毒活疫苗 374

（1）重组痘苗病毒疫苗 374

（2）对重组病毒活疫苗的评价 375

三、重组DNA技术与工业生产 375

1.纤维素的开发利用 375

2.酿酒工业 376

3.干酪生产 377

4.新型蛋白质的生产 377

四、重组DNA技术与农业 378

1.转基因植物 378

2.转基因动物 379

主要参考文献 380

名词术语解释 382

索引 388