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第一章 背景知识 1

分子杂交技术 1

探针-靶分子的相互作用 1

杂交技术新进展 3

一般原则 8

探针选择和特异性 8

杂交速率 8

探针浓度 10

严格性 10

杂交促进剂 11

应用范围 12

重组DNA实验室技术 12

细菌检测 12

病毒检测 13

哺乳类序列 14

参考文献 15

第二章 样品制备 20

引言 20

核酸的提取与沉淀 20

方法2.1 DNA的苯酚抽提 21

乙醇沉淀 22

方法2.2 DNA的乙醇沉淀 22

高分子量DNA的乙醇沉淀 23

方法2.3 缠绕法分离高分子量DNA 23

乙醇沉淀的替代方法 24

DNA产率及纯度的测定 24

血液DNA的提取 24

方法2.4 肝素化全血中单核淋巴细胞的分离 25

方法2.5 人血清中HBV DNA的提取 26

血清DNA的提取 26

血液白细胞核的快速分离 26

组织DNA的提取 27

方法2.6 新鲜或冰冻组织DNA的提取 28

方法2.7 从石蜡包理的组织中提取DNA 28

细菌DNA的提取 29

方法2.8 细菌细胞DNA的提取 29

RNA的提取 30

RNA操作注意事项 30

氧钒核糖核苷复合物-苯酚抽提法 30

方法2.9 氧钒核糖核苷复合物（RVC）的制备 31

方法2.10 细胞浆RNA的分离 31

利用异硫氰酸胍分离RNA 32

方法2.11 异硫氰酸胍分离RNA的方法Ⅰ 33

方法2.12 异硫氰酸胍分离RNA的方法Ⅱ 34

方法2.13 脲-氯化锂抽提RNA的方法 35

方法2.14 多聚（A1）RNA的纯化 36

其它来源样品核酸的提取 37

粪便 37

方法2.15 粪便标本的制备Ⅰ——DNA的提取 38

方法2.16 粪便标本的制备Ⅱ——直接斑点印迹法 38

尿液 39

方法2.17 尿样CMV的提取 39

其它样品 40

原位杂交所用细胞和组织的制备 41

封固细胞或组织之前载玻片的预处理 41

方法2.18 载玻片的酸洗 42

方法2.19 用APES预处理载玻片 42

方法2.20 用聚L-赖氨酸预处理载玻片 42

方法2.21 乙醇:乙酸固定 43

用于原位杂交细胞的固定 43

用于原位杂交细胞的制备 43

方法2.22 4%副甲醛固定 44

方法2.23 载玻片的福尔马林固定 44

用于原位杂交的组织制备 45

方法2.24 冷冻组织切片的制备 45

方法2.25 组织的福尔马林固定与石蜡包理 46

染色体原位杂交 46

方法2.26 中期扩散相的制备 47

方法2.27 吉姆萨（Giemsa）分带 47

参考文献 48

第三章 放射性标记方法 52

引言 52

一般原则 52

DNA的缺口平移 55

通过酶学修饰标记DNA 55

方法3.1 通过缺口平移用放射性核苷酸标记DNA 56

DNA酶Ⅰ消解作用的优化 57

通过随机引物标记DNA 57

方法3.2 通过随机引物法用放射性核苷酸标记DNA 59

从M13模板合成探针 60

放射性标记的RNA探针 61

方法3.3 35S标记RNA探针的转录 62

寡核苷酸探针 63

由寡脱氧核苷酸模板产生RNA探针 63

方法3.4 从合成的单链寡核苷酸转录[35S]RNA探针 63

接尾 寡核苷酸探针的制备 64

方法3.5 利用末端脱氧核苷酸转移酶进行寡核苷酸接尾 65

寡核苷酸5 端的标记 65

其它标记方法 66

方法3.6 用T4多聚核苷酸激酶标记5 端 66

方法3.7 用TCA沉淀法测定比活性 67

放射性标记探针的纯化 68

凝胶过滤法 68

方法3.8 利用Sephadex柱纯化标记探针 68

方法3.9 利用QuiCkSpin柱纯化DNA 69

标记探针的乙醇沉淀 69

方法3.10 用乙醇沉淀纯化标记探针 69

方法3.11 变性聚丙烯酰胺凝胶 70

疏水层析—Nensorb柱 71

方法3.12 用Nensorb柱纯化克隆的DNA 71

方法3.13 三苯甲基寡核苷酸探针的纯化 72

参考文献 73

第四章 非放射性标记方法 75

引言 75

酶学修饰 77

方法4.1 通过缺口平移法用修饰的核苷酸标记DNA 78

探针检查 81

方法4.2 靶分子检查条的制备 81

方法4.3 通过随机引物法用修饰核苷酸标记克隆的DNA 82

克隆DNA片段的接尾 82

方法4.4 用修饰核苷酸给克隆DNA片段接尾 83

方法4.5 8-氨已基-dATP（AH—dATP）的合成 85

生物素化的RNA探针 86

方法4.6 RNA转录体中生物素核苷酸的掺入 86

化学修饰 87

用生物素进行化学标记 88

方法4.7 DNA的光化生物素标记 88

用半抗原进行化学标记 89

方法4.8 DNA的光化DNP标记 90

方法4.9A 光化DNP的合成 91

方法4.9B DNP一二氨基已烷的合成 92

DNA的连接臂修饰 93

方法4.10 用亚硫酸氢盐和二氨基已烷修饰DNA 93

溴介导的DNA修饰 95

方法4.11 用溴和二氨基已烷修饰DNA 96

寡核苷酸探针 97

方法4.12 寡核苷酸探针的酶促接尾 98

方法4.13 氨基一寡核苷酸探针的合成和纯化 99

将检测基团加到氨基寡核苷酸上 100

方法4.14 寡核苷酸探针的生物素标记 101

酶联反应Ⅰ 102

方法4.15 利用均一的双功能连接臂酶标寡核苷酸探针 103

酶联反应Ⅱ 105

方法4.16 利用非均一双功能连接臂酶标寡核苷酸探针 105

参考文献 106

第五章 杂交方式和检测方法 110

引言 110

滤膜杂交 111

斑点印迹杂交 111

方法5.1 DNA的斑点印迹 112

方法5.2 RNA的斑点印迹 113

胞浆斑点杂交 113

方法5.3 胞浆斑点杂交 113

完整细胞的斑点印迹 114

方法5.4 利用斑点印迹快速筛选培养细胞的DNA序列 114

Southern印迹杂交 115

琼脂糖凝胶电泳 116

方法5.5 琼脂糖凝胶电泳 116

方法5.6 Southern印迹转移至硝酸纤维素膜 117

方法5.7 DNA从琼脂糖转移至尼龙膜 118

Southern转移至尼龙膜 118

RNA的Northern印迹 119

方法5.8 RNA的羟甲基汞凝胶电泳和转移条件 120

方法5.9 RNA的甲醛凝胶电泳和转移条件 121

菌落和噬斑筛选 122

方法5.10 从平板上复制克隆 122

方法5.11 裂解细胞并将DNA固定到滤膜上 123

滤膜杂交方法 124

方法5.12 滤膜与放射性标记探针的杂交 124

放射自显影 125

方法5.13 放射自显影 126

滤膜的再探测 126

非放射性滤膜杂交条件 127

方法5.15 非放射性探针的一般滤膜杂交条件 127

方法5.14 从滤膜上洗脱放射性标记的探针 127

半抗原检测 129

方法5.16 滤膜上半抗原标记探针的比色检测 129

生物素检测 130

方法5.17 滤膜上生物素标记探针的一步法比色检测 130

替代方法 131

方法5.18 滤膜上生物素标记探针的两步法比色检测 131

化学发光检测 132

方法5.19 滤膜的化学发光检测 132

过氧化物酶的检测 132

碱性磷酸酶的检测 133

方法5.20 尼龙膜上生物素标记探针的去除 133

原位杂交 133

方法5.21 用Denhardt溶液预处理载玻片 135

方法5.22 使用非放射性探针时福尔马林固定、石蜡包埋载玻片的预处理 136

预杂交 137

杂交 137

方法5.23 使用33S标记探针的原位杂交 137

杂交后处理 138

放射自显影 139

载玻片染色 139

方法5.24 杂交后载玻片的苏木精染色 139

方法5.25 使用半抗原或生物素标记探针的原位杂交 140

方法5.26 半抗原标记探针的显色 141

方法5.27 生物素标记探针的显色 141

检测溶解的靶分子的杂交方式 142

亲和捕捉 142

均质溶液杂交测定 143

夹心式（sandwich）杂交 146

方法5.29 微滴度孔中的夹心杂交 147

微滴度孔的准备 148

夹心杂交 149

预杂交（8孔） 149

孔条显色 150

其它方式 153

参考文献 154

第六章 探针和靶分子扩增系统 159

引言 159

靶核酸扩增 159

聚合酶链式反应 159

方法6.1 用于PCR的样品制备方法 162

方法6.2 从全血中快速制备PCR样品 162

方法6.3 利用PCR酶促扩增靶DNA 163

产物的杂交分析 163

基于转录的扩增系统 165

探针扩增 166

Qβ复制酶系统 166

探针网络 167

参考文献 168

附录A 试剂 171

缓冲液和试剂 171

配制方法 174

方法A.1 杂交缓冲液的大量制备 174

方法A.2 用于碱性磷酸酶的NBT和BCIP底物溶液 175

方法A.3 用于碱性磷酸酶的INT和BCIP底物溶液 176

方法A.4 用于碱性磷酸酶的坚牢红底物 176

方法A.5 乙酰化牛血清清蛋白（BSA）的制备 177

方法A.6 5×接尾缓冲液的配制 177

参考文献 178

DNA换算表 178

换算系数 178

核苷酸的消光系数 179

换数公式 179

DNA和RNA的定量 179

米制前缀 179

DNA的编码能力 179

缩略语表 180

附录B 其它方法 181

方法B.1 兔抗DNP抗体的制备 181

NHS-氨基已酸-DNP的合成 181

DNP-BSA的制备 182

家兔的免疫 182

血清的处理 182

方法B.2 碱性磷酸酶与抗体的结合 183

方法B.3 FITC-二氨基已烷的合成 184

方法B.4 FITC与BSA的偶联 184

参考文献 185

附录C 国外厂商地址及产品介绍 186