分子选殖 遗传工程理论及实验手册PDF电子书下载

第一章 媒介与宿主系统 1

（壹）质体 2

一　选殖DNA至质体中的方法 10

（贰）λ噬菌体 15

一 溶裂循环 18

二 潜溶作用 21

三 制造λ噬菌体媒介 22

四 选择适当的媒介 23

五 λ媒介的遗传图 24

（叁）凝聚质体 44

（肆）拥有单股核酸的噬菌体 50

（伍）结论 51

第二章　菌株及噬菌体的繁殖与保存 55

壹 菌落的纯化程序 57

贰 菌株的生长，维持与保存 59

叁 λ噬菌体溶菌斑的纯化程序 61

肆 培养基与抗生素 65

第三章 λ噬菌体及质体DNA的分离 71

壹 大量λ噬菌体的制备 72

（壹）噬菌体的感染 72

（贰）噬菌体的诱发 73

（叁）λ噬菌体的纯化 75

（肆）λ噬菌体DNA的抽取 79

贰 质体DNA大量分离法 80

（壹）菌体的生长以及质体的繁殖 81

（贰）菌体的收集与溶裂 82

（叁）利用Cesium Chloride-Ethidium Bromide密度梯度衡定离心的技术纯化环状DNA 85

（肆）质体DNA样品中RNA的去除 86

第四章　分子选殖必需的酶类 89

壹 限制酶 90

（壹）同座限制酶 91

（贰）甲基化作用 94

（叁）利用限制酶分解DNA 96

贰 适用于分子选殖技术的他种酶类 98

（壹）大肠菌DNA聚合酶Ⅰ 98

（贰）大肠菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段 103

（叁）T4 DNA聚合酶 107

（肆）利用T4聚核苷酸激酶标志DNA的5′末端 112

（伍）转录RNA的DNA聚合酶 117

（陆）DNA脱磷酸作用 122

（柒）Bal 31核酸酶 124

核酸酶S1 128

绿豆核酸酶 129

核糖核酸酶 129

脱氧核糖核酸酶Ⅰ 130

外核酸酶Ⅶ 130

外核酸酶Ⅲ 131

λ外核酸酶 132

聚（A）聚合酶 133

T4 DNA接合酶 134

T4 RNA接合酶 135

Eco RI修饰酶 135

末端脱氧核糖核苷酸转移酶 136

第五章　胶体电泳 137

壹 琼脂糖胶体电泳 138

（壹）胶体电泳器 140

（贰）缓冲液 140

（叁）琼脂糖胶体的配制 143

（肆）琼脂糖胶体中DNA的染色 146

（伍）胶体的照像 147

（陆）迷你胶体 147

（柒）琼脂糖胶体上DNA的回收 149

（捌）碱性琼脂糖胶体 154

贰 聚丙烯醯胺胶体电泳 155

（壹）聚丙烯醯胺胶体的装备方法 156

（贰）DNA自聚丙烯醯胺胶体上的回收 160

叁　DNA分股用的胶体 160

（壹）利用聚丙烯醯胺胶体分离DNA的两股 161

（贰）利用琼脂糖胶体分离DNA的两股 162

（叁）利用变性溶液与聚丙烯醯胺胶体电泳分离短小DNA的两股 164

第六章　真核细胞m-RNA的抽取，纯化与分析 167

（壹）分离哺乳动物细胞中的mRNA 170

（贰）细胞中全部RNA的分离法 172

（叁）聚腺苷酸RNA的筛选 174

（肆）RNA的胶体电泳 176

（伍）利用核酸酶S1图谱RNA 182

第七章　反讯息DNA的合成及选殖 185

壹 反讯息DNA的合成 186

（壹）反讯息DNA第一股的制造 186

（贰）反讯息DNA第二股的制造 188

（叁）利用核酸酶S1切除反讯息DNA上的发夹状圆弧 189

贰 双股反讯息DNA的分子选殖 190

（壹）含同种聚合物的尾端 190

（贰）人工制造的DNA接头 192

（叁）选殖反讯息DNA的其他方法 194

叁 反讯息DNA选殖的策略 197

（壹）量多mRNA转录为反讯息DNA 197

（贰）量少mRNA转录为反讯息DNA 198

肆 选殖反讯息DNA的程序 203

（壹）双股反讯息DNA的合成方法 203

（贰）利用核酸酶S1分解反讯息双股DNA 209

（叁）反讯息双股DNA的选殖 212

（肆）媒介DNA与反讯息双股DNA的氮基冷却配对 215

（伍）利用先后添加接头的方式选殖反讯息双股DNA 215

第八章　转移质体及λ噬菌体DNA于大肠菌体内的技术 219

壹 转化质体DNA于大肠菌体内的程序 220

（壹）使用氯化钙的转化程序 221

（贰）使用氯化钙与氯化铷的转化程序 222

（叁）使用大肠菌x1776菌株的转化程序 223

贰 在活体外装填λ噬菌体DNA的方法 225

（壹）潜溶性λ噬菌体的保存与测定 227

（贰）制造装填用噬菌体——程序Ⅰ 229

（叁）活体外装填DNA——序Ⅰ 230

（肆）制造装填用噬菌体——程序Ⅱ 232

（伍）活体外装填DNA——程序Ⅱ 234

第九章　建立基因组集合库 237

壹 利用λ噬菌体媒介建立基因组的集合库 238

（壹）制造媒介DNA 242

（贰）利用组织培养皿上的真核细胞分离高分子量的DNA 246

（叁）制备长度为20kb的真核细胞DNA 248

（肆）DNA的接合与装填 252

（伍）集合库中噬菌体的增数 257

贰 利用凝聚质体建立基因组集合库 258

（壹）利用磷酸盐酶处理的凝聚质体作为携带选殖DNA的媒介 259

（贰）利用两种限制酶及磷酸盐酶处理的凝聚质体作为携带选殖DNA的媒介 263

（叁）含有选殖DNA的集合库的增数，贮存，以及筛选 267

第十章　含有重组DNA的纯系的鉴定 271

壹 菌落或溶菌斑的原位杂合 273

（壹）少量菌落的杂合 273

（贰）复印菌落于硝化纤维滤纸上的程序 276

（叁）利用杂合作用鉴定λ噬菌体的溶菌斑 278

（肆）λ噬菌体溶菌斑在原位增数后再以杂合法鉴定的程序 280

（伍）固定于滤片上的DNA或RNA与辐射性探测核酸杂合的程序 281

（陆）复印有噬菌体溶菌斑或者细菌菌落的滤片与探测核酸杂合的程序 283

贰 利用杂合筛选法鉴定含有反讯息DNA的菌落或噬菌体 286

（壹）利用固定于硝化纤维滤片上的DNA从事杂合筛选 286

（贰）利用杂合作用筛选的RNA在网织红血球溶裂液中转译产生蛋白质 295

（叁）注射mRNA于蛙卵细胞中以转译的方式产生蛋白质 299

叁 利用探测DNA与特定序列的DNA在大肠菌体内重组的现象筛选集合库中携带特殊外来DNA段落的λ噬菌体 302

（壹）重组筛选法的原理 302

（贰）筛选πVX质体用的菌株 306

（叁）πVX质体的制备 306

（肆）质体进入W3110r-m+（P3）菌株的转化作用 306

（伍）利用λ噬菌体集合库感染W3110r-m+（P3）（πVX）菌株 307

（陆）鉴定噬菌体的阻遏基因 307

（柒）测试πVX质体系统 307

（捌）πVX系统的应用 310

第十一章　含重组DNA纯系的分析 313

壹 λ噬菌体DNA或者质体DNA的快速分离 314

（壹）质体DNA小规模快速的分离 314

（贰）λ噬菌体DNA小规模快速的分离 317

贰 建立DNA上限制座分布的图形 319

（壹）单一或共同分解 320

（贰）依次分解 321

（叁）局部分解 323

叁 Southern转移法 326

（壹）转移琼脂糖胶体中的DNA至硝化纤维滤纸上的程序 327

（贰）DNA转移至滤片上以后的杂合程序 329

肆 分殖小假DNA于质体媒介中的程序 331

（壹）具有凝聚末端的DNA的分殖法 332

（贰）利用人造接头协助DNA的分殖工作 333

（叁）接合二齐尾DNA作为产生限制座的方法 337

（肆）选殖步骤快速依次进行的方法 339

第十二章　能够在大肠菌体内表现其所携带之选殖DNA的媒介质体 341

壹 促进因子 342

（壹）利用λ噬菌体的PL促进因子的媒介质体 343

（贰）其他的促进因子 347

贰 核糖体结合座 347

叁 真核细胞基因的表现 348

（壹）使选殖DNA产生非融合性真核细胞蛋白质的媒介 348

（贰）使选殖DNA产生融合性真核细胞蛋白质的媒介 355

肆 选殖基因的高度表现 366

伍 增加基因的数量 369

陆 摘要 370

附录 373

壹 附录A：生化技术 374

（壹）玻璃及塑胶器皿 374

（贰）配制有机溶剂 375

（叁）液体培养基 376

（肆）含洋菜或者琼脂糖的固体培养基 378

（伍）浓缩培养基 378

（陆）用于λ噬菌体实验的溶液 378

（柒）抗生素 379

（捌）缓冲液与其他溶液的配制 380

（玖）酶类 385

（拾）限制酶分解程序必需的缓冲液 387

（拾壹）常用的电泳缓冲液 388

（拾贰）常用的装填染料 389

（拾叁）透析膜袋的清洗 390

（拾肆）乙醇与水混合溶液中32P-核苷酸的干燥方法 390

（拾伍）核酸的纯化 391

（拾陆）核酸的浓缩 393

（拾柒）Sephadex G-50层析程序 395

（拾捌）DNA及RNA的定量 398

（拾玖）自动辐射照像术 400

（贰拾）测量核酸的辐射活性 402

（贰拾壹）剪接质体成长短不一的段落作为分子量比较的标志 403

（贰拾贰）Maxam-Gilbert的DNA序列分析技术 404

贰 附录B：pBR322 408

（壹）pBR322的核苷酸序列 408

（贰）pBR322上的限制座 417

（叁）pBR322 DNA上含有限制座的段落 422

叁 附录C：常用的细菌菌株 433

参考文献 437

索引 451