第一章 绪论 1
第一节 组织化学发展的基础 1
一、细胞生物学发展与组织化学 1
二、生物化学发展与组织化学 2
三、免疫学发展与组织化学 2
四、分子生物学发展与组织化学 3
第二节 组织化学发展简史 3
一、组织化学的兴起 3
二、现代组织化学的发展 4
三、我国组织化学发展概况 5
第三节 组织化学技术基本要求 6
一、组织化学的分支和分类 6
二、组织化学技术的基本要求 7
第二章 组织化学与免疫组织化学染色样品制备 8
第一节 取材 8
一、组织标本取材 8
二、细胞标本取材 9
（一）培养细胞 9
（二）涂片法 9
第二节 固定 9
一、组织和细胞的固定方法 9
（一）浸润法 9
（二）灌流固定法 9
二、常用固定剂和固定方法 10
（一）组织常用固定剂和固定方法 10
（二）培养细胞常用固定剂和固定方法 11
第三节 包埋和切片 11
一、石蜡包埋 11
（一）包埋前脱水 12
（二）透明 12
（三）浸蜡 12
（四）包埋 12
（五）修块 12
二、切片 12
（一）石蜡切片 12
（二）冰冻切片 13
（三）振动切片 14
三、防脱片处理步骤 14
（一）载玻片和盖玻片的处理 14
（二）黏附剂的使用 14
（三）免疫组织化学染色中常见脱片原因 15
科学史话——幽门螺杆菌与胃溃疡 15
第三章 组织化学 18
第一节 核酸组织化学 18
一、Feulgen反应 18
（一）原理 18
（二）Schiff液的配制 19
（三）Feulgen反应步骤 19
二、吖啶橙染色 20
（一）吖啶橙区分活细胞DNA和RNA的荧光组织化学染色法 20
（二）吖啶橙原位区分组织细胞DNA和RNA的荧光组织化学染色法 21
三、Hoechst 33258染色 22
四、DAPI染色 23
五、溴化乙啶和碘化丙啶染色法 24
（一）溴化乙啶染色 24
（二）碘化丙啶染色 25
第二节 脂类组织化学 25
一、乙醇苏丹黑B染色法 26
（一）染色程序 26
（二）注意事项 26
二、油红O染色法 26
（一）油红O染液的配制 27
（二）染色程序 27
第三节 酶组织化学 27
一、酶组织化学的基本原理及一般原则 27
（一）酶组织化学的基本原理 27
（二）酶显示方法 28
（三）酶组织化学对组织处理的基本要求 29
二、常用酶组织化学染色方法 30
（一）磷酸酶 30
（二）三磷酸腺苷酶 34
（三）羧酸酯水解酶 35
（四）氧化酶和脱氢酶 37
（五）一氧化氮合酶 40
第四节 凝集素组织化学 41
一、凝集素的标记物 42
二、染色程序 42
（一）FITC标记凝集素的组织化学染色程序 42
（二）辣根过氧化物酶标记凝集素的组织化学染色程序 42
（三）生物素标记凝集素的组织化学染色程序 43
第五节 荧光组织化学 43
一、组织细胞荧光分类 44
（一）自发荧光 44
（二）诱发荧光 44
（三）酶促荧光 44
（四）荧光染色 44
（五）免疫荧光 44
二、生物胺荧光组织化学 44
（一）Falck-Hillarp甲醛诱发荧光法 45
（二）乙醛酸诱发生物单胺荧光法 45
（三）邻苯二醛显示组胺荧光法 46
科学史话——周期蛋白的发现 47
第四章 免疫组织化学技术 50
第一节 免疫组织化学基本原理 50
一、直接法 50
二、间接法 51
三、亲和免疫组织化学 51
（一）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法 52
（二）链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法 53
第二节 免疫组织化学染色步骤 54
一、SABC法免疫组织化学染色步骤 54
（一）石蜡切片免疫组织化学染色 54
（二）冰冻切片免疫组织化学染色 57
（三）培养细胞免疫细胞化学染色 57
二、SABC法与其他免疫组织化学染色方法比较 58
（一）SP法或SAP法 58
（二）EnVision TM Systems 58
（三）MaxVision法 58
三、免疫组织化学染色结果评价 59
（一）以抗原表达模式定位 59
（二）阳性染色结果定量 59
四、讨论 59
（一）实验计划 59
（二）抗体的稀释度 60
（三）滴加抗体注意事项 60
（四）抗体的保存 60
（五）对照实验 61
（六）免疫组织化学技术应用的基本原则 61
（七）疑难问题剖析 62
第三节 免疫组织化学双重染色 64
第四节 免疫荧光组织化学技术 65
一、荧光的基本知识 65
（一）荧光 65
（二）荧光物质的特性和种类 65
二、免疫荧光组织化学基本原理及方法 69
（一）基本原理 69
（二）基本方法 69
三、免疫荧光组织化学染色步骤 71
（一）直接法 71
（二）间接法 71
（三）SABC-Cy3法 72
（四）双重染色法 72
（五）膜抗原荧光抗体染色法 73
（六）补体法 73
（七）荧光抗体再染色法 74
四、非特异性荧光染色的消除 74
五、生物荧光显微镜 75
（一）荧光显微镜的分类及主要组成 75
（二）荧光显微镜的基本操作及注意事项 77
六、激光扫描共聚焦显微镜 78
（一）激光扫描共聚焦显微镜基本原理 78
（二）激光扫描共聚焦显微镜操作步骤及注意事项 79
（三）组织芯片中免疫荧光染色的定量分析 81
应用举例——免疫荧光组织化学双重染色在神经元发生研究中的应用 82
第五章 原位杂交组织化学 84
第一节 原位杂交组织化学基本原理 84
一、核酸的化学组成与基本结构 84
二、DNA变性与复性 85
（一）变性 85
（二）复性 86
第二节 核酸分子杂交 86
第三节 核酸分子探针 87
一、探针的种类 87
（一）基因组DNA探针 88
（二）cDNA探针 88
（三）cRNA探针 88
（四）寡核苷酸探针 88
二、探针的标记 90
（一）探针标记物 90
（二）探针标记方法 90
第四节 原位杂交组织化学基本程序 93
一、标本制备 94
（一）取材 94
（二）固定 94
（三）切片 95
二、杂交前处理 96
（一）增强组织通透性和核酸探针穿透性 96
（二）减低背景染色 96
三、杂交反应 97
（一）双链DNA探针和靶DNA变性 97
（二）杂交液 97
（三）探针长度 97
（四）探针浓度 97
（五）杂交温度和时间 98
（六）杂交严格度 98
四、杂交后处理 98
五、杂交体检测 99
（一）放射性核素标记探针的检测 99
（二）非放射性标记探针的检测 99
六、对照实验 100
（一）组织对照 100
（二）探针对照 100
（三）杂交反应对照 101
（四）检测系统对照 101
第五节 原位杂交组织化学技术进展 101
一、原位PCR技术 101
二、荧光原位杂交技术 103
三、胚胎原位杂交技术 104
四、双重和多重原位杂交技术 104
（一）放射性核素和非放射性标记探针的双重标记原位杂交 105
（二）非放射性标记探针的双重标记原位杂交 105
（三）两种放射性核素标记探针的双重标记原位杂交 106
五、原位杂交结合免疫组织化学技术 106
六、电镜原位杂交技术 107
（一）电镜原位杂交的特点 108
（二）常用电镜原位杂交技术的基本程序 109
七、肽核酸原位杂交 109
科学史话——割裂基因的发现 110
第六章 电镜组织化学与免疫电镜技术 113
第一节 电镜技术 113
一、透射电子显微镜基本原理 113
二、超薄切片技术 113
（一）固定 113
（二）脱水 116
（三）浸透与包埋 116
（四）超薄切片制作 118
三、观察与记录 120
第二节 电镜组织化学技术 122
一、基本原理 122
（一）酶组织化学反应过程 122
（二）酶反应底物的特异性 122
（三）捕捉反应 122
二、样品制备 122
三、结果观察 123
第三节 免疫电镜技术 124
一、免疫电镜技术的特点 124
（一）组织取材与固定 124
（二）染色方法 124
（三）包埋 126
（四）对照实验 127
二、几种常用电镜免疫染色技术 127
（一）免疫铁蛋白电镜技术 127
（二）免疫酶电镜技术 128
（三）免疫胶体金电镜技术 130
（四）免疫纳米金电镜技术 132
第七章 组织化学与免疫组织化学定量分析技术 135
第一节 显微图像分析 135
一、显微图像分析系统组成 136
二、基本术语和常用测量参数 136
（一）像素与灰度 136
（二）色彩 136
（三）光密度 137
（四）长度 137
（五）面积 137
三、吸光和发光组织样品的常用测量参数 137
（一）吸光组织细胞样品的测量 137
（二）发光组织细胞样品的测量 137
四、显微图像分析处理程序 138
（一）制作切片样品 138
（二）获取图像 138
（三）图像分割 138
（四）测量 139
（五）统计分析 139
（六）结果输出 139
五、显微图像分析应用中的注意事项 139
（一）设计在先，测试在后 139
（二）测试样本的代表性 139
（三）实验操作过程的一致性 140
（四）图像分析系统输入条件的一致性 140
（五）图像分析系统现有参数的局限性 140
（六）二维定量信息的局限性 140
第二节 流式细胞术 140
一、流式细胞仪的工作原理 140
二、流式细胞术在组织化学与免疫组织化学中的应用 141
（一）流式细胞术的常用样品制备方法 142
（二）免疫荧光标记样品 143
（三）流式细胞术数据处理与分析 144
（四）运用流式细胞仪计数细胞应注意的问题 145
第三节 激光扫描共聚焦显微镜技术 146
一、激光扫描共聚焦显微镜在组织化学和免疫组织化学中的应用 146
（一）光学切片 147
（二）三维图像重建 147
（三）荧光标记物的定位和定量分析 148
二、激光扫描共聚焦显微镜定量分析的优势 150
三、注意事项 150
（一）制备高特异性和高效价的荧光抗体 150
（二）标本制作要求 151
（三）定量研究的要求 151
第四节 体视学 151
一、体视学的基本概念及基本原则 152
（一）二维图像与三维结构之间的关系 152
（二）几何探针 152
（三）卡瓦列里原理 154
（四）随机抽样 157
二、常用体视学方法在免疫组织化学中的应用 161
（一）特征物断面计数与轮廓密度 161
（二）长度密度和总长度 163
（三）面积分数、平均面积、体积分数和总体积 165
（四）交叉点密度、边线密度、表面积密度和总表面积 167
（五）数目测量 168
应用举例——体视学在雌激素替代治疗改善老年大脑功能研究的应用 176
第八章 显微摄影技术 178
第一节 摄影基础 178
一、照相机镜头 179
（一）照相机镜头口径 179
（二）照相机镜头种类与焦距 179
二、控制曝光 180
（一）光圈 180
（二）快门 181
（三）胶片的感光度 182
三、景深 182
（一）光圈口径对景深的影响 182
（二）镜头焦距对景深的影响 182
（三）物距对景深的影响 182
四、感光片 182
（一）彩色负片 182
（二）彩色反转片 182
（三）感光度 183
（四）反差 183
五、常用滤色镜的作用 183
（一）原色光和补色光 183
（二）滤色镜的特性 183
（三）滤色镜在摄影中的应用 184
六、色温 184
第二节 显微摄影基础 185
一、显微镜的几何光学成像原理 185
二、分辨率与放大率 185
三、显微镜的主要部件 187
（一）视场光阑和孔径光阑 187
（二）聚光镜 188
（三）物镜 188
（四）目镜 189
四、柯勒照明 190
五、几种常用特殊显微镜的结构与原理 190
（一）相差显微镜 190
（二）微分干涉显微镜 193
第三节 显微摄影技术应用 195
一、普通显微摄影技术应用 195
（一）显微镜的使用环境 195
（二）摄影前准备 195
（三）显微照相的操作步骤 196
（四）胶卷的选用 197
（五）显微照片放大倍数的标注方法 197
二、特殊显微摄影技术应用 197
三、数码显微摄影技术 198
（一）数码摄影的基本原理 198
（二）数码显微摄影技术应用 202
参考文献 204
第九章 组织化学与免疫组织化学实验指导 206
实验一 组织标本石蜡切片和冰冻切片的制备 206
（一）石蜡切片和HE染色标本制备 206
（二）冰冻切片标本制备 209
实验二 DNA的Hoechst33258和DAPI荧光组织化学染色 210
（一）DNA的Hoechst 33258荧光组织化学染色 210
（二）DNA的DAPI荧光组织化学染色 211
实验三 脂类的异丙醇油红○法染色 212
实验四 钙-钴法显示碱性磷酸酶 213
实验五 偶氮偶联法显示酸性磷酸酶 214
实验六 胆碱酯酶染色——Kamovsky-Roo ts法 215
实验七 还原型辅酶Ⅱ-黄递酶（NA DPH-d）染色 216
实验八 免疫组织化学实验——SABC法 217
实验九 免疫荧光细胞化学染色（间接法） 219
实验十 半抗原标记cRNA探针原位杂交组织化学染色 220
附录一 免疫组织化学染色常用试剂配制 223
（一）固定液 223
（二）缓冲液 225
（三）常用消化液 227
（四）显色液 227
（五）黏附剂 228
（六）封固剂 229
（七）其他 229
附录二 原位杂交试剂配制 231