1 现代生物技术革命 1
1.1 现代生物技术的产生 1
1.1.1 传统生物技术 1
1.1.2 现代生物技术 2
1.1.3 现代生物技术的进展 3
1.2 现代生物技术的商业化 6
1.2.1 现代生物技术商业化的前景 6
1.2.2 现代生物技术商业化的特点 7
1.3 现代生物技术的前景 8
1.3.1 现代生物技术对人类生活的影响 9
1.3.2 现代生物技术对人类社会及环境的影响 9
1.3.3 现代生物技术的规范化管理 10
1.4 现代生物技术与中国 11
1.4.1 中国现代生物技术的应用成果 11
1.4.2 中国现代生物技术的基础研究成果 13
1.4.3 中国面临的现代生物技术R D的挑战 14
2 DNA重组技术与基因操作 15
2.1 DNA的结构与功能 15
2.1.1 DNA分子的基本结构 15
2.1.2 DNA分子的基本功能 17
2.2 限制性内切酶 18
2.2.1 类型Ⅱ限制性内切酶的特点 18
2.2.2 类型Ⅱ限制性内切酶的主要用途 20
2.3.1 质粒 22
2.3 克隆载体 22
2.3.2 λ噬菌体 25
2.3.3 柯斯质粒 26
2.3.4 YAC载体 27
2.4 原核细胞的转化与筛选 29
2.4.1 转化 29
2.4.2 筛选 29
2.5 原核生物基因文库的构建和筛选 30
2.5.1 基因文库的构建 30
2.5.2 基因文库的筛选 31
2.6.1 cDNA方法 34
2.6 获得真核生物目的基因的方法 34
2.6.2 DNA的化学合成 35
2.6.3 利用PCR法获得基因 38
3 原核生物的基因表达与操作 42
3.1 原核生物的基因表达 42
3.1.1 原核生物基因的转录 42
3.1.2 原核生物基因的翻译 43
3.2 有功能的启动子的分离 44
3.2.1 用大肠杆菌质粒pBR316筛选启动子 45
3.2.2 用pKOL筛选启动子 46
3.3 可调控强启动子驱动的基因表达 48
3.3.1 可调控的启动子 48
3.3.2 常用原核表达载体 51
3.3.3 提高蛋白的表达量 53
3.3.4 大规模培养系统 55
3.3.5 在其他微生物中的表达 56
3.3.6 非融合蛋白的表达 57
3.3.7 融合蛋白的表达及纯化 58
3.3.8 单一方向串联排列的基因 60
3.3.9 增强蛋白的稳定性 61
3.3.10 DNA整合入宿主染色体中 62
3.3.11 加强分泌 64
3.4 原核生物表达产物的分离纯化 64
3.4.1 包函体蛋白提取 65
3.4.2 表达蛋白纯化方法选择的基本原则 66
3.4.3 蛋白质的PEG化 67
3.4.4 原核表达蛋白的质量控制 68
4 基因诱变及蛋白质工程 72
4.1 蛋白质工程简介 72
4.2 基因诱变 73
4.2.1 用M13 DNA进行的寡核苷酸介导诱变 73
4.2.2 寡核苷酸介导的PCR诱变 74
4.2.3 改进型双引物诱变 76
4.2.4 重叠延伸诱变 77
4.2.5 简并寡核苷酸引物 77
4.3 定点诱变在蛋白质工程中的应用 78
4.2.6 随机诱变 78
4.3.1 提高T4溶菌酶的热稳定性 80
4.3.2 对酵母磷酸丙糖异构酶的改造 81
4.3.3 提高蛋白热稳定性的其他方法 81
4.3.4 提高重组β干扰素的专一活性和稳定性 82
4.3.5 改进al抗胰蛋白酶 82
4.3.6 改变酶的动力学活性 84
4.3.7 改变酶的最适pH值 86
4.3.8 提高酶的活性 86
4.3.9 改善酶的特异性 87
4.3.10 提高蛋白的生物学活性 88
4.4.2 利用缺失诱变改造蛋白质 91
4.4 蛋白质改造的其他常用方法 91
4.4.1 对四级结构未知的蛋白质进行改造 91
4.4.3 利用结构域互换进行蛋白质改造 92
4.5 用蛋白质工程对限制性内切酶进行改造 93
4.5.1 蛋白质工程在应用中的复杂性 93
4.5.2 用蛋白质工程对限制性内切酶进行改造 93
5 通过重组原核微生物生产商品 97
5.1 生产蛋白药物 97
5.1.1 重组蛋白药物生产的主要步骤 98
5.1.2 几种较成熟的重组蛋白药物 100
5.2 生产限制性内切酶 101
5.2.1 大肠杆菌作为重组限制性内切酶基因的表达系统 101
5.2.3 Ddel基因的克隆及表达 102
5.2.2 PstI基因的克隆及表达 102
5.3 生产生物小分子 104
5.3.1 合成维生素C(抗坏血酸) 104
5.3.2 合成靛蓝 107
5.3.3 生产氨基酸 108
5.3.4 生产抗生素 109
5.4 生产生物多聚体 113
5.4.1 生产黄原胶 113
5.4.2 生物合成黑色素 115
5.4.3 生产粘性生物多聚体 115
5.4.4 生物合成橡胶 116
5.4.5 生产生物可降解塑料 117
6 现代发酵工程 119
6.1 微生物生长动力学 119
6.1.1 罐批发酵 119
6.1.2 补料分批发酵 120
6.1.3 连续发酵 122
6.2 发酵过程的优化 123
6.3 生物反应器 125
6.3.1 搅拌釜反应器 127
6.3.2 气泡柱式反应器 128
6.3.3 气升式反应器 128
6.4 典型的大规模发酵系统 130
6.3.4 其他生物反应器 130
6.4.1 在串联的气升式反应器中进行两步发酵 131
6.4.2 一个搅拌釜式反应器中进行的两步发酵 132
6.4.3 影响发酵效率的其他因素 133
6.5 发酵产品的下游处理 136
6.5.1 收获微生物细胞 137
6.5.2 微生物细胞的破碎 138
6.5.3 目的产物的纯化 141
7 现代生物农药 144
7.1 微生物杀虫剂 144
7.1.1 病毒杀虫剂 145
7.1.2 用DNA重组技术改造杆状病毒杀虫剂 148
7.1.3 细菌杀虫剂 151
7.1.4 真菌杀虫剂 159
7.2 动物杀虫剂 162
7.2.1 原生动物杀虫剂 162
7.2.2 线虫杀虫剂 162
7.3 防治植物病害的微生物 164
7.3.1 用于植病防治的细菌及放线菌 164
7.3.2 用DNA重组技术对抗病细菌进行改造 165
7.3.3 抗病真菌和病毒 165
7.4 生物除草剂 168
8 现代微生物肥料 170
8.1 微生物的固氮作用 170
8.2.1 固氮酶 173
8.2 固氮酶及其基因 173
8.2.2 固氮酶的基因簇及其改造 175
8.3 氢化酶 178
8.3.1 氢气代谢 179
8.3.2 对氢化酶的基因工程改造 179
8.4 结瘤作用 181
8.4.1 结瘤微生物之间的竞争 181
8.4.2 结瘤基因的克隆及功能 181
8.5 其他固氮微生物 183
8.5.1 弗氏放线菌 183
8.5.3 具有联合固氮作用的细菌 184
8.5.2 蓝细菌 184
8.6 其他促进植物生长的细菌 185
8.6.1 铁载体 185
8.6.2 植物激素 186
9 生物净化与生物废料再生 187
9.1 现代生物技术在降解非生物物质中的应用 187
9.1.1 生物降解途径的基因工程 190
9.1.2 利用微生物降解农药 195
9.1.3 利用绿色植物清除污染物 197
9.2 淀粉和其他含糖废液的利用 198
9.2.1 利用淀粉和其他含糖废液生产果糖和乙醇的常规方法 199
9.2.2 利用DNA重组技术对果糖和乙醇生产方法进行改进 200
9.3.1 木质纤维的成分 204
9.3 木质纤维的利用 204
9.3.2 原核生物中纤维素酶基因的分离 206
9.3.3 真核生物纤维素酶基因的分离 208
9.3.4 纤维素酶基因的改造 209
9.3.5 利用微生物由半纤维素生产乙醇 211
9.4 利用微生物生产蛋白质 211
9.4.1 微生物蛋白的营养价值 212
9.4.2 单细胞蛋白的生产 213
9.4.3 利用木腐性食用菌生产蛋白 214
9.5 污水的微生物净化 214
9.5.1 污水的分类及特点 214
9.5.2 用微生物处理污水的机制 214
9.5.3 可用于污水处理的微生物 215
9.6 微生物采矿 216
10 真核细胞中重组蛋白的表达 218
10.1 酵母表达系统 218
10.1.1 啤酒酵母的基因组结构及其特点 219
10.1.2 啤酒酵母的转化 219
10.1.3 啤酒酵母的载体 220
10.1.4 在啤酒酵母中直接表达外源蛋白 223
10.1.5 在啤酒酵母中表达分泌型的重组蛋白 224
10.1.6 其他酵母表达系统 225
10.1.7 乙肝病毒表面抗原在嗜甲烷酵母中的表达 225
10.1.8 牛溶菌酶C2在嗜甲烷酵母中的表达 226
10.2 培养的昆虫细胞表达系统 227
10.2.1 杆状病毒转化载体 228
10.2.2 杆状病毒系统大规模应用中的一些问题 231
10.3 哺乳动物细胞的表达系统 232
10.3.1 适用于哺乳动物细胞的载体 232
10.3.2 用于表达外源蛋白的哺乳动物细胞系 234
10.3.3 获得转基因哺乳动物细胞的方法 235
10.3.4 在哺乳动物细胞中生产蛋白药物供临床试验 237
11 植物基因工程 241
11.1 植物转化的方法 241
11.1.1 植物的再生 241
11.1.2 利用农杆菌的Ti质粒进行植物转化 242
11.1.3 Ti质粒衍生的载体系统 245
11.1.4 将基因转入植物的物理方法 248
11.1.5 病毒衍生载体 249
11.1.6 报道基因在植物基因转化中的应用 249
11.2 植物抗病的分子机理及抗病基因工程 250
11.2.1 植物的抗病反应 250
11.2.2 植物抗病基因(R)的克隆 252
11.2.3 杀茵肽基因工程 254
11.3 农作物基因工程 254
11.3.1 培育抗虫植物 254
11.3.2 培育抗病毒作物 260
11.3.3 培育抗除草剂作物 265
11.3.4 培育耐受环境压力和抗衰老的作物 266
11.3.5 改进农产品的品质 272
11.4 花卉基因工程 274
11.4.1 利用基因工程改变花卉颜色 274
11.4.2 利用基因工程改变花形和花期 276
11.5 雄性不育基因工程 277
11.6 利用植物作为生物反应器 281
11.6.1 利用植物生产糖类物质 281
11.6.2 利用植物生产可降解的生物塑料的原料 282
11.6.3 利用植物生产蛋白质和多肽 282
11.7 转基因植物的生物安全性问题 285
12 转基因动物 288
12.1 转基因鼠的研究方法 288
12.1.1 反转录病毒法 289
12.1.2 DNA微注射法 290
12.1.3 胚胎干细胞方法 293
12.2 转基因鼠的应用 296
12.2.1 人类疾病的转基因动物模型 297
12.2.2 利用转基因鼠进行基因敲除实验 301
12.2.3 利用转基因鼠克隆在发育中起重要作用的基因 302
12.2.4 利用转基因鼠研究细胞的功能 303
12.2.5 利用转基因鼠作为外源基因的表达系统 304
12.3 其他转基因动物 304
12.3.1 转基因牛 304
12.3.2 转基因棉羊、山羊和猪 306
12.3.3 转基因禽类 308
12.3.4 转基因鱼 310
12.5 克隆动物 311
12.4 转基因动物的应用前景 311
13 单克隆抗体和抗体工程 315
13.1 抗体的结构与功能 315
13.2 单克隆抗体 317
13.2.1 杂交瘤细胞系的产生 317
13.2.2 杂交瘤细胞的鉴定 319
13.3 单克隆抗体的改造和应用 321
13.3.1 单克隆抗体靶向制剂 322
13.3.2 杂交人-鼠单克隆抗体 323
13.3.3 人源单克隆抗体 325
13.3.5 抗体酶 326
13.3.4 抗体融合蛋白 326
13.3.6 单链抗体 328
13.4 抗体的表达系统 328
13.4.1 在重组噬菌体中筛选生产抗体 329
13.4.2 在植物中生产抗体 334
14 现代分子诊断技术 338
14.1 酶联免疫吸附测定 338
14.1.1 酶联免疫吸附测定的原理 338
14.1.2 酶联免疫吸附测定的局限性 339
14.2 DNA诊断系统 340
14.2.1 核酸杂交 340
14.2.2 疟疾的分子诊断 342
14.2.3 细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术 343
14.3 遗传疾病的分子诊断技术 345
14.3.1 PCR-酶解鉴定 345
14.3.2 PCR/OLA鉴定 346
14.3.3 LCR鉴定 348
14.3.4 PCR-ELISA检测 351
14.3.5 同一基因中多个不同位点的突变的检测 351
14.4 癌症的分子诊断技术 354
14.5 环境微生物的检测 357
15 预防性及治疗性疫苗 359
15.1 疫苗简介 359
15.2 基因工程疫苗 362
15.2.1 亚基疫苗 363
15.2.2 肽疫苗 365
15.3 DNA免疫 367
15.4 活体重组疫苗及其载体 368
15.4.1 活体重组疫苗 368
15.4.2 活体疫苗载体 369
15.4.3 门哥病毒载体 376
15.4.4 金丝雀痘病毒载体 377
15.4.5 仙台病毒疫苗载体 377
15.4.6 麻疹病毒疫苗载体 377
15.4.6 沙门氏菌属疫苗表达系统 377
15.5.1 抗细菌疫苗 379
15.5 细菌及其他疫苗 379
15.5.2 抗独特型抗体疫苗 380
15.5.3 移植器官的排斥反应的预防 380
15.5.4 细菌造成的血液感染的治疗 381
15.5.5 恶性疟原虫疫苗 381
15.5.6 免疫避孕疫苗 383
15.6 艾滋病疫苗 384
15.6.1 HIV病毒简介 384
15.6.2 HIV病毒的致病机理 384
15.6.3 HIV的生活史及治疗药物 386
15.7.1 肿瘤细胞的一些免疫特性 391
15.7 肿瘤疫苗 391
15.7.2 肿瘤细胞疫苗 392
15.7.3 活体重组疫苗 396
15.7.4 肽疫苗 397
15.7.5 抗独特型抗体疫苗 398
15.7.6 双特异性抗体 399
15.7.7 树状细胞免疫 401
15.7.8 DNA免疫 401
15.8 针对自身免疫疾病的疫苗 401
15.9.4 其他治疗性疫苗 404
15.9.2 单纯疱疹病毒疫苗 404
15.9.3 麻风病治疗性疫苗 404
15.9.1 乙型肝炎治疗性疫苗 404
15.9 治疗性疫苗 404
16 人类基因的克隆 407
16.1 人类基因组计划及其研究方法 407
16.1.1 定位克隆法 408
16.1.2 利用染色体异常来克隆与遗传疾病有关的基因 411
16.1.3 定位候选克隆法 411
16.2 遗传连锁与基因作图 412
16.2.1 限制性片段长度多态性 415
16.2.2 RFLP在人类基因组作图中的应用 416
16.3.1 逼近致病基因 420
16.3 人类基因的分离筛选方法 420
16.2.3 人类遗传疾病作图 420
16.3.2 外显子序列的获得 424
16.4 定位克隆法的局限性 431
17 人类疾病的基因治疗 433
17.1 基因治疗的回顾及现状 433
17.2 基因治疗中的基因转移载体 439
17.2.1 反转录病毒载体 439
17.2.2 腺病毒载体 443
17.2.3 腺病毒相关病毒载体 447
17.2.4 重组痘苗病毒载体 449
17.2.5 单纯疱疹病毒载体 450
17.2.6 染色体外自主复制载体 451
17.3.1 化学方法 453
17.3 基因治疗中外源基因导入的化学和物理方法 453
17.3.2 物理方法 454
17.4 基因治疗的方式 454
17.4.1 体外-原位基因治疗 455
17.4.2 体内基因治疗 456
17.5 反义疗法 457
17.5.1 反义疗法中亟待解决的问题 457
17.5.2 反义药物的转移方法 459
17.6 通过核酶进行的基因治疗 461
17.6.1 核酸的结构与功能 461
17.6.2 核酶的基因治疗中的应用 463
17.6.3 核酶的运载系统 464
17.6.4 核酶的表达载体 465
17.7 癌症的基因治疗 467
17.7.1 导入抑癌基因的基因治疗 467
17.7.2 针对癌基因的基因治疗 468
17.7.3 “自杀”基因 468
17.7.4 导入细胞因子基因进行基因治疗 469
17.7.5 导入MHC Ⅰ类抗原基因进行基因治疗 470
17.7.6 导入MDR 1基因进行基因治疗 470
17.7.7 细胞融合法 470
17.8.6 肝病的基因治疗 472
17.8.5 血友病的基因治疗 472
17.8.4 胆固醇疾病的基因治疗 472
17.8.3 严重综合性免疫缺损症的基因治疗 472
17.8.1 艾滋病的治疗 472
17.8 其他疾病的基因治疗 472
17.8.2 囊性纤维化的基因治疗 472
17.8.7 遗传性神经疾病的基因治疗 473
17.8.8 帕金森氏病的基因治疗 476
17.9 基因治疗的前景 477
17.9.1 基因治疗的伦理和社会问题 477
17.9.2 基因治疗的技术问题 477
17.9.3 基因治疗的展望 479
18 现代生物技术的规则与专利 480
18.1 现代生物技术制药的规则及要求 480
18.1.2 基因工程药物生产环境的要求 481
18.1.1 基因工程药物审批的一般程序 481
18.1.3 ISO证书 483
18.2 现代生物技术与中草药研究 484
18.3 现代生物技术专利 485
18.3.1 申请专利的要求 485
18.3.2 现代生物技术专利类型 487
18.3.3 专利的地域性 489
18.3.4 专利与基础研究 490
18.4 现代生物技术的社会伦理问题 491
附录 493
主要参考书目 501
索引 502