第一篇 基因工程 3
第一章 基因工程原理 3
一、基因工程概念 3
二、基因工程的操作技术 4
(一)超高速离心 5
(二)限制性内切酶和连接酶 5
(三)凝胶电泳 5
(四)分子杂交 5
(五)DNA序列分析 8
(六)分子转化和筛选 8
(七)检验 8
三、基因工程概貌 9
(一)基因工程概貌图解 9
(二)外源片段插入方法简介 10
(三)载体传递 11
(四)筛选 11
四、基因工程载体--质粒和λ噬菌体 12
(一)基本概念 12
(二)质粒DNA的纯化 13
(三)质粒克隆载体的性质 15
(四)载体质粒的构建 16
(五)λ噬菌体 19
实验：用λ噬菌体构建基因组文库 22
实验一 外源DNA片段与λ噬菌体DNA的连接及连接产物的体外包装 24
实验二 文库效价(滴度)的测定 27
实验三 基因组文库的筛选 29
实验四 λ噬菌体的生长和繁殖 31
实验五 λ-DNA的提取和纯化 32
参考文献 33
第二章 质粒的稳定性与重组菌的培养 34
一、质粒的稳定性 34
(一)测定质粒稳定性的方法 34
(二)质粒不稳定的类型 35
二、提高质粒稳定性的方法 40
(一)选择压力法 40
(二)非选择压力法 41
三、重组工程菌的培养 45
(一)分段培养 45
(二)细胞高密度培养 46
参考文献 47
第三章 利福霉素产生菌GS酶基因工程研究进展 48
一、地中海诺卡氏菌的发现及特点 48
二、硝酸盐对利福霉素合成途径的全面调控作用 50
(一)硝酸盐对三羧酸循环关键酶活力的调节 51
(二)硝酸盐对地中海诺卡氏菌氮代谢的调节 52
(三)硝酸盐对(C7N)合成及莽草酸途径的调节 53
三、地中海诺卡氏菌谷氨酰胺合成酶的基因克隆及表达 56
(一)地中海诺卡氏菌GS酶基因克隆的意义 56
(二)谷氨酰胺合成酶的基因克隆方法简介 57
(三)质粒pLTl的酶切图谱分析 59
(四)硝酸盐对E.coli YMCll(pLTl)谷氨酰胺合成酶比活力的促进 60
(五)质粒pLTl的亚克隆及亚克隆子的酶切图谱分析 61
(六)谷氨酰胺合成酶结构基因的确定 62
(七)地中海诺卡氏菌GS酶基因转录方向的确定 63
(八)含双质粒菌株的筛选及硝酸盐调节区的定位 66
(九)重组质粒的稳定性研究 67
参考文献 69
第四章 植物抗病毒基因工程 70
一、概述 70
二、对当前采用策略的评价 71
(一)外壳蛋白(CP) 71
(二)病毒卫星RNA基因策略 73
(三)反义RNA 75
(四)复制酶 76
(五)核酶 77
(六)移动蛋白(MP) 78
三、提高工程植株抗性的联合策略 79
(一)多抗性基因共同转化植物以获得不同抗性基因的表达 79
(二)多基因共同转化植物的途径 79
四、抗病毒策略的探讨 80
(一)阻断病毒基因功能表达 80
(二)植物本身的应急反应 81
(三)正在研究的途径--抗体基因 82
(四)抗病毒的新概念 82
实验：获得表达卫星PNA和外壳蛋白的高抗黄瓜花叶病毒的转基因烟草 84
参考文献 96
第二篇 微生物细胞工程 101
第五章 微生物的原生质体融合及应用 101
一、融合子的选择方法 102
(一)利用营养缺陷型选择融合子 102
(二)利用抗药性选择融合子 103
(三)应用灭活原生质体选择融合子 104
(四)利用荧光染色选择融合子 105
(五)利用不同碳源选择融合子 105
二、原生质体融合的应用 106
(一)病毒传递 106
(二)核的转移 106
(三)质粒转移 107
(四)耐热性研究及菌种筛选 108
(五)改良菌种 108
(六)抗生素研究 109
(七)酶的研究 110
实验：细菌和酵母菌原生质体融合 111
实验一 细菌原生质体融合 112
实验二 酵母菌单倍体原生质体融合 117
实验三 电场诱导酵母原生质体融合 120
参考文献 123
第三篇 微生物发酵工程 127
第六章 微生物工程 127
一、微生物工程的概念和意义 127
(一)何谓微生物工程 127
(二)微生物工程的内容 128
(三)微生物工程的优越性 129
二、微生物工程的发展 130
三、微生物工程中的常用微生物 131
四、微生物发酵过程的简介 134
(一)氨基酸发酵常用的微生物类型和菌株 135
(二)具体实例--谷氨酸棒杆菌homˉ突变株的赖氨酸发酵 136
五、新技术在工业微生物育种上的应用 137
(一)原生质体融合 137
(二)体外基因重组 138
实验：高产壳聚糖酶及蛋白酶真菌菌株的筛选 144
参考文献 148
第四篇 特殊(生理)类型微生物的研究进展 151
第七章 微生物的固氮作用 151
一、前言 151
二、生物固氮的种类 153
(一)好氧固氮微生物 155
(二)兼性厌氧固氮微生物 158
(三)厌氧固氮微生物 162
(四)蓝细菌(蓝绿藻) 163
三、非豆科树木-弗氏放线菌共生固氮系统 167
四、豆科植物-根瘤菌共生固氮系统 168
(一)豆科植物及其结瘤情况 168
(二)豆科植物和根瘤菌的相互作用 169
(三)豆科植物寄主-根瘤菌之间的识别 176
(四)根瘤菌及其分类 177
(五)豆科植物-根瘤菌系统在农牧业上的应用 180
五、生物固氮中的几个遗传学问题 184
(一)固氮基因群 184
(二)结瘤基因 187
实验：细菌16SrRNA序列测定 192
参考文献 201
第八章 芳香烃的微生物降解及其遗传控制 202
一、概述 202
二、芳香族化合物的微生物降解 203
(一)降解芳香烃的微生物 203
(二)降解芳香烃化合物的途径 204
(三)对多环芳香烃裂解途径 214
(四)对卤代芳烃的降解 215
(五)对苯氧基烷基羧酸的降解 216
三、降解质粒及其遗传控制 218
(一)降解质粒 218
(二)降解途径的遗传控制 221
四、遗传工程菌的构建 223
(一)质粒转移构建多质粒菌株 224
(二)利用质粒突变筛选高效降解菌 225
(三)遗传工程菌侏构建 228
实验：降解苯酚微生物的选育 231
参考文献 235
第九章 厌氧菌的生物学 237
一、前言 237
二、厌氧菌研究简史及研究方法的发展 239
三、厌氧菌的定义 240
四、厌氧菌的类型 241
五、厌氧菌的生理生化特性 242
(一)底物的氧化 243
(二)还原型辅酶的重新氧化 246
(三)合成代谢 248
(四)细菌适应氧化还原电位的改变 248
(五)氧对好氧菌及厌氧菌的毒性 248
六、厌氧菌与人类的生活 252
(一)厌氧过程对环境的影响 252
(二)厌氧菌的工业应用 254
实验：厌氧技术和厌氧菌的分离培养 257
参考文献 262
第十章 极端环境微生物 263
一、极端嗜热菌 264
(一)一般习性 264
(二)代表菌种 265
(三)微生物耐高温的机制 268
(四)嗜热菌的实际应用 269
二、极端嗜盐菌 270
(一)一般特性 270
(二)嗜盐菌的生理 271
(三)嗜盐菌的紫膜 273
三、极端嗜碱菌 273
(一)极端嗜碱菌的生理 275
(二)嗜碱菌的研究意义 276
四、极端嗜酸菌 277
五、极端嗜冷菌 278
六、极端嗜压菌 279
七、极端微生物与古细菌的关系 280
(一)古细菌在生物界的位置 280
(二)古细菌的重要特征 282
参考文献 286
第五篇 若干重要领域的研究进展 289
第十一章 真核微生物的类金属硫蛋白 289
一、蛋白质的理化特性 290
(一)类似哺乳动物的MT 291
(二)类似植物的chelatin 293
(三)半胱氨酸含量低的第三类 293
(四)既含MT，又含chelatin 294
二、MTs和PCs的结构 295
(一)类MTs结构 295
(二)PCs的结构 298
(三)真核微生物Cu-MT的“铜簇” 298
三、MT的基因结构、基因放大及基因调控 299
(一)基因结构 299
(二)基因放大 303
(三)酵母菌MT基因的调控 308
四、酵母菌MTs的应用 314
(一)生物药学 314
(二)金属回收 315
(三)MT启动子的应用 316
(四)CUPl基因座调控外源基因的放大 319
实验：酿酒酵母金属硫蛋白发酵 320
参考文献 325
第十二章 真菌细胞壁的研究概况 328
一、真菌细胞结构的概念 328
(一)基本结构及其特点 328
(二)厌氧真菌细胞的特殊结构 330
二、真菌细胞壁的研究意义及研究方法 331
(一)研究意义 331
(二)研究方法简介 332
三、真菌细胞壁的结构和成分 335
(一)真菌细胞壁的成分及其分类 335
(二)粗糙脉孢菌及酿酒酵母的细胞壁成分 337
(三)真菌中的几丁质 338
四、几丁质的合成及真菌细胞壁的生长 340
(一)真菌细胞壁的生长 340
(二)几丁质的合成部位 341
(三)几丁质的合成作用 347
五、细胞壁成分变化与细胞分化过程的相关性 353
(一)概述 353
(二)培养中成分变化对真菌细胞壁组成的影响 354
(三)有性及无性孢子和营养菌丝细胞壁成分的不同 356
(四)真菌激素对细胞壁结构成分的影响 357
实验：真菌细胞壁成分的分离和检测 360
参考文献 364
第十三章 微生物杀虫毒素的研究概况 366
一、杀虫细菌--苏云金杆菌的毒素 366
(一)δ-内毒素的形态和结构 366
(二)蛋白质晶体的生化和血清学特性 367
(三)蛋白质晶体的多样性 368
(四)蛋白质晶体毒系的致病机理 369
(五)Btδ-内毒素的分子生物学研究进展 372
二、苏云金杆菌的其他毒素 376
(一)热稳定性外毒素--β-外毒素 376
(二)α-外毒素 377
(三)γ-外毒素 377
三、杀虫真菌--球孢白僵菌的毒素 378
(一)球孢白僵菌产生的毒素种类及其性质 378
(二)白僵菌毒素的杀虫机理 380
实验：球孢白僵菌毒素的分离、纯化及生物测定 382
参考文献 384