第一章 概论 1
第一节 EIA技术基本原理 1
第二节 EIA研究历史和发展动态 2
第三节 EIA技术的优缺点 7
一、EIA技术的优越性 7
（一）灵敏度高 8
（二）特异性强 8
（三）对仪器设备要求不高，测定成本低 8
（四）方法快速、简便 8
（五）试剂保存时间较长 9
（六）自动化程度高 9
（七）方法种类多 9
（八）无放射性同位素污染 9
二、EIA技术的潜在危害 10
（一）准备建立EIA方法时可能遇到的危险 10
（二）EIA操作过程中的危害性 10
第四节 EIA技术在生物科学中的应用前景 12
一、在医学与兽医学领域的应用前景 12
（一）疾病诊断 12
（二）流行病学调查 13
（三）妊娠诊断 13
（四）排卵期预测 13
二、在畜牧学科中的应用前景 13
（一）家畜育种学 13
（二）家畜繁殖学 14
（三）家畜饲养与饲料生产学 14
（四）其他 14
三、在植物学科中的应用前景 14
（一）植物育种 14
（二）在植物保护和植物生理学研究中的应用前景 15
四、在食品工业中的应用前景 16
（一）食品中有毒有害物质的监测 16
（二）肉品蛋白质的鉴别 16
五、在环境保护学科中的应用前景 17
主要参考文献 18
第二章 EIA方法的分类和工作原理及其基本操作条件 21
第一节 根据酶促反应特点分类 21
一、AA型EIA方法 22
（一）半抗原测定 22
（二）抗原测定 23
（三）抗体测定 24
二、AM型EIA方法 24
（一）邻连酶系统 25
（二）抗体掩盖或增强酶活性 25
（三）抗体掩盖酶底物 26
（四）抗体掩盖酶的辅因子或辅酶 27
（五）抗原直接调节酶活性 27
（六）亲和素调节酶活性 28
三、混合型或顺序型 28
四、AA型与AM型方法的特点比较 28
（一）灵敏度 28
（二）特异性 29
（三）准确性 29
（四）操作速度和简便性 29
第二节 根据抗原-抗体反应动力学分类 30
一、竞争性EIA 30
二、非竞争性EIA 31
第三节 根据抗原和抗体在反应体系中的存在方式分类 31
一、固相EIA方法 31
（一）ELISA法 32
（二）DASS法 32
二、液相EIA方法 33
（一）双抗体法 33
（二）HEIA法 34
第四节 根据反应体系与检测体系之间的关系分类 34
一、直接法 36
二、间接法 36
第五节 建立EIA方法应具备的条件 36
一、基本条件 37
（一）免疫原 37
（二）标准品 37
（三）抗体 38
（四）分离技术 38
（五）酶标记物 38
（六）酶底物系统 38
（七）检测酶活性的仪器 39
（八）加样器及其他设备 39
（九）缓冲液 39
二、自动化操作条件 39
（一）自动加样设备 40
（二）自动清洗仪 40
（三）自动读数器 40
主要参考文献 40
第三章 酶与底物系统 42
第一节 酶促反应基本原理 42
一、酶的催化特性 43
二、单底物酶的催化特性 44
三、复合底物酶促反应的动力学 47
四、米-曼氏常数的测定方法 48
五、酶活性的抑制 52
第二节 影响酶促反应的因素 54
一、温度 54
二、溶液pH 55
三、缓冲液成分和离子强度 56
四、固相载体 56
第三节 酶活性测定 60
一、酶活性与纯度的关系 60
二、配对酶的活性测定 61
三、循环酶系统中酶活力的测定 62
四、酶活性的光度测定 63
第四节 EIA中常用的酶及其底物系统 64
一、用于AA型EIA中的酶 67
（一）辣根过氧化物酶 67
（二）β-半乳糖苷酶 85
（三）碱性磷酸酶 88
（四）葡萄糖氧化酶（GO酶） 95
（五）脲酶 99
二、用于活性调节EIA方法中的酶 101
（一）溶菌酶 101
（二）苹果酸脱氢酶 105
（三）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（GPD酶） 107
（四）核糖核酸酶（RNA酶） 110
主要参考文献 110
第四章 抗体理化特性和制备方法 114
第一节 抗体的性质 114
一、抗体的概念和分类 114
（一）抗体的概念 114
（二）抗体的分类 114
二、抗体的化学性质和基本结构 117
三、哺乳动物的抗体 121
四、禽类抗体 122
第二节 抗体形成的基本原理 123
一、产生抗体的细胞 124
二、抗体的产生及其一般规律 126
三、抗体生成的调节 和免疫耐受 128
（一）免疫调节 128
（二）免疫耐受 130
第三节 多克隆抗体的制备 131
一、制备多克隆抗体的条件 131
（一）免疫原 131
（二）佐剂 133
（三）用于免疫的动物 133
二、免疫操作程序 134
（一）免疫原与佐剂的乳化 135
（二）注射乳化液的方法（初次免疫） 136
（三）加强免疫 137
（四）血液收集 137
第四节 单克隆抗体的制备 139
一、单克隆抗体的生产原理 141
二、制备单克隆抗体的操作流程 143
（一）免疫动物和骨髓瘤细胞系的选择 143
（二）脾脏细胞和饲养细胞的制备 147
（三）融合和融合剂 149
（四）杂交瘤细胞的筛选与选择培养基的配制 150
（五）抗体检测 153
（六）杂交瘤细胞的克隆化 153
（七）单克隆抗体的生产 156
（八）杂交瘤细胞的冷冻保存 156
（九）体外免疫法制备单克隆抗体 157
第五节 IgG的分离和Fab片段的制备 157
一、多克隆抗血清中免疫球蛋白的分离 158
（一）污染蛋白质的选择性沉淀 158
（二）盐析 159
（三）离子交换层析法 162
（四）亲和层析法提纯IgG 167
二、从卵黄中分离IgY 176
三、单克隆抗体的纯化 176
四、免疫球蛋白的纯度和质量鉴定 177
五、Fab片段的制备和纯化 177
（一）水解蛋白质的常用方法 178
（二）Fab片段和Fab片断的纯化 180
第六节 抗体的半抗原化 181
一、抗体半抗原化的原理 181
二、抗体半抗原化的方法 183
主要参考文献 186
第五章 两种物质的偶联 189
第一节 偶联的基本原理 189
一、偶联方法简介 189
二、偶联条件的选择 191
（一）被偶联的两种物质的浓度及其相对比率 191
（二）偶联剂的选择 196
（三）缓冲液的选择 197
第二节 两种大分子物质的偶联 198
一、化学偶联 198
（一）戊二醛法 199
（二）过碘酸钠法 204
（三）对苯醌法 211
（四）邻苯二马莱酰亚胺法（OPDM法） 213
（五）BSNHS法 220
（六）TDIC法 221
（七）FNPS法 223
（八）CDI法 224
（九）NHS法 225
（十）NHS-FBA法 230
（十一）SPDP法 232
二、免疫学偶联 233
（一）各种抗体的制备 235
（二）免疫复合物的制备 236
（三）免疫复合物中酶与抗体克分子比例的计算 238
三、化学-生物学偶联 239
第三节 大分子与小分子的偶联 242
一、建立偶联方法的基本要求 243
（一）载体蛋白和半抗原分子中反应基团的选择 243
（二）偶联剂的选择 246
（三）偶联条件的选择 247
（四）蛋白质分子中的基团数及其估算方法 251
（五）半抗原与蛋白质偶联比率的确定 252
二、各种半抗原与蛋白质的偶联 253
（一）分子中含羟基或可羟化的半抗原的偶联 253
（二）含氨基或可还原硝基半抗原的偶联 256
（三）含巯基半抗原的偶联 257
（四）含羟基半抗原的偶联 258
（五）含醛基或酮基半抗原的偶联 260
（六）其他半抗原的偶联 260
第四节 偶联物的纯化和保存 263
一、偶联物的纯化原理 263
（一）离心法 264
（二）透析法 264
（三）层析法 265
二、偶联物的保存原理 266
三、大分子-大分子偶联物的纯化和保存 268
（一）过氧化物酶-IgG的纯化和保存 268
（二）其他酶标记物的纯化和保存 269
四、半抗原-大分子偶联物的纯化和保存 270
第五节 偶联物的质量评定 271
一、浓度测定 271
（一）紫外吸收法 272
（二）双缩脲法 274
（三）Folin-酚法 274
（四）微量凯氏定氮法 275
（五）染料结合法 275
（六）荧光法 276
二、纯度鉴定和结构分析 276
三、偶联物中两种分子偶联比率的估算 279
（一）分光光度法 279
（二）同位素示踪法 283
（三）根据偶联物的分子量估算偶联比率 284
（四）其他方法 284
四、酶标记物中酶活性和免疫活性的测定 284
主要参考文献 286
第六章 用于EIA的非免疫识别物质 292
第一节 亲和素/生物素系统 292
一、亲和素化学本质及理化特性 292
二、亲和素的提取和纯化 294
（一）从蛋清中提取 294
（二）从阿维丁链球菌中提取 295
三、亲和素和生物素的含量测定 295
四、生物素的活化 296
（一）生物素-对硝基苯酯的合成 296
（二）生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯的合成 298
（三）己酰胺基-BNHS酯的合成 299
（四）生物素-重氮苯胺的合成 300
（五）生物素-酰肼的制备 301
（六）生物素-溴乙酰肼的合成 301
五、生物素与蛋白质的偶联 301
第二节 葡萄球菌A蛋白 302
一、基本特性 303
（一）SPA的理化特性 303
（二）SPA的生物活性 304
二、SPA的提取和纯化 306
（一）菌种 306
（二）细菌的培养 307
（三）SPA的提取 308
（四）SPA的纯化与纯度鉴定 309
三、含SPA葡萄球菌的固相化方法 309
（一）TCA热固定法 310
（二）福尔马林固定法 310
四、SPA与蛋白质（酶）的偶联方法 310
（一）SPDP法 311
（二）过碘酸钠法 311
五、葡萄球菌G蛋白 312
（一）基本特性 312
（二）SPG与各种动物IgG的结合能力 312
第三节 凝集素 312
一、凝集素的基本特性 312
二、ConA的提取和纯化 315
三、凝集素酶标记物的制备 316
第四节 胶固素 316
一、胶固素和补体的理化特性和生物学特性 317
二、胶固素的提取和纯化 318
（一）酵母菌体悬液的制备 318
（二）胶固素的提取 318
（三）胶固素的纯化 319
三、胶固素纯度鉴定和活性测定 319
（一）纯度鉴定 319
（二）活性测定 319
四、胶固素酶标记物的制备 320
主要参考文献 320
第七章 抗原抗体反应动力学和固相化 323
第一节 抗原抗体反应动力学 323
一、抗原抗体反应的理化特性 323
二、影响抗原-抗体复合物稳定性的因素 325
三、抗体EIA最适工作浓度、滴度和亲和常数测定 326
四、抗原-抗体作用动力学 332
五、亲合力的概念及其在EIA中的意义 333
六、免疫测定中的交叉反应性、特异性和多特异性 337
七、酶免疫测定的免疫反应动力学 340
（一）AM型酶免疫测定的动力学 340
（二）AA型酶免疫测定的动力学 344
第二节 免疫反应物和非免疫识别物的固相化 348
一、固相化的基本原理 349
（一）物理吸附 349
（二）化学偶联 349
二、塑料固相载体的特性和使用 350
（一）蛋白质与塑料的相互作用 351
（二）抗原与塑料的非共价吸附 354
（三）抗体或抗原在塑料上的共价连接 357
（四）用桥分子将抗原或抗体连接到塑料载体上 360
（五）半抗原的固相化 362
（六）塑料固相载体的形状 363
三、硝化纤维膜（和纸）载体 364
（一）抗原与硝化纤维素膜的斑点连接 366
（二）可溶性抗原与硝化纤维素膜的连接 367
（三）包被物与纸的共价偶联 367
（四）纸的非共价键斑点免疫连接 370
四、玻璃固相载体 371
五、颗粒固相载体 372
六、其他固相载体 374
七、影响固相载体固定效果的因素 375
（一）固相载体 375
（二）被固定物质 375
（三）固定（包被）温度与时间 376
（四）固定缓冲液 377
主要参考文献 377
第八章 各种EIA方法操作原理和方法及其注意事项 381
第一节 固相EIA技术 382
一、非竞争性固相EIA 385
（一）包被抗原的非竞争性EIA方法 385
（二）包被抗体或补体的非竞争性EIA 391
（三）免疫球蛋白分类捕获方法 394
二、竞争性固相EIA 395
（一）固定抗体的竞争性EIA 395
（二）固定抗原的竞争性EIA 397
第二节 均质酶免疫测定方法 400
一、竞争性均质EIA 400
（一）酶标记半抗原的竞争性均质EIA 400
（二）用亲和素配位体作酶活性调节剂的均质EIA 403
（三）底物标记抗原的均质EIA 404
（四）酶标记抗体竞争性均质EIA 405
（五）辅因子标记抗原的竞争性均质EIA 406
第三节 EIA中酶活性的测定 407
一、固相EIA中酶活性的测定 407
（一）辣根过氧化物酶底物液配制和酶活性测定 407
（二）β-半乳糖苷酶活性的测定 414
（三）碱性磷酸酶活性的测定 414
（四）葡萄糖氧化酶活性的测定 415
（五）脲酶活性的测定 415
二、均质EIA中酶活性测定 415
第四节 酶免疫测定新方法 415
一、提高灵敏度的新方法 416
（一）环式EIA 416
（二）酶免疫荧光底物法 416
（三）化学发光酶免疫测定 417
（四）放射活性底物法 418
（五）抗体遮蔽酶尾固相EIA测定 419
二、其他实用方法 419
（一）测热EIA 420
（二）亲和层析EIA 420
（三）毛细管免疫迁移EIA 421
（四）凝胶扩散EIA 421
（五）酶通道免疫测量 422
（六）均相酶调节剂调节免疫测定 423
主要参考文献 423
第九章 数据处理与结果表达方法 427
第一节 定量检测抗体的数据处理和结果表达方法 427
一、使用参考血清的意义 427
二、检测抗体的结果表达方法 429
（一）肉眼观测法 429
（二）滴定法 429
（三）有效剂量法 430
（四）剂量反应曲线标准单位法 431
（五）吸光值法 432
（六）比值法 433
（七）当量活性倍数法 434
（八）百分位数估测法 437
三、结果可靠性评定 437
第二节 定量检测抗原或半抗原的数据处理和结果报告方法 439
一、标准曲线的建立 439
二、标准曲线的拟合和线性化 440
（一）A-LogC作图法 441
（二）A/A0-LogC作图法 441
（三）Logit-Log作图法 442
（四）四参数Logitic函数 442
三、袖珍计算器在数据统计中的应用 446
（一）LogitA/A0数据转移程序 446
（二）线性回归程序 446
（三）浓度计算 447
（四）数据组的平均数及标准差和变异系数计算程序 447
（五）计算双份样本均数和标准差及变异系数的程序 447
主要参考文献 448
第十章 EIA质量控制和常见错误分析 449
第一节 EIA质量控制 449
一、质量控制的定义、目的和意义 449
二、误差来源与质量控制类别 450
（一）误差分类与来源 450
（二）质量控制类别 451
三、质量控制指标及其影响因素和改进措施 451
（一）精密度 451
（二）灵敏度 457
（三）准确度 461
（四）特异性 462
（五）稳定性 464
四、质量控制的具体方法 465
（一）标准曲线的拟合 465
（二）样本测定中随机误差的监测及个别坏点的判断和剔除 466
（三）系统误差的监测及整批结果的舍弃 467
第二节 影响标准曲线建立的因素和异常标准曲线的原因分析 471
一、影响标准曲线建立的因素及其解决办法 472
（一）标准品 472
（二）样本中的干扰物质 472
（三）反应体系中pH和离子强度 473
（四）反应温度和时间 473
（五）反应容量 474
（六）反应物浓度 474
（七）某些特殊样本中的影响因素 475
（八）样本贮存 476
（九）酶底物系统 476
二、异常标准曲线的原因分析 476
（一）标准曲线斜率偏低 476
（二）标准曲线斜率不变，但最低吸光值偏高或最大吸光值偏低 477
（三）标准曲线呈勾变型 477
（四）标准曲线上某点或某两点位置漂移 478
第三节 EIA试剂盒使用中的一些问题 478
一、样本吸光值高于标准曲线最大吸光值 478
二、样本吸光值低于标准曲线最小吸光值 479
三、最大吸光值较低 479
四、试剂盒经一次测定后第二次测定中标准曲线不成型的原因 479
主要参考文献 480
附录 482
一、EIA常用缓冲液的配制 482
二、Logit N值计算 488
三、常用冷冻剂的制备 490
四、常用葡聚糖凝胶和生物胶的性质 491
五、EIA常用缩略语 493
六、常用物质国际单位与重量间的换算 503
后记 506