第一章 苹果汁中的扩展青霉污染及PCR技术研究现状 1
第一节 我国苹果及其加工生产状况 2
一、苹果特性及其营养价值 2
二、我国苹果的生产现状与发展前景 3
三、我国苹果加工面临的竞争与挑战 4
第二节 棒曲霉毒素 6
一、理化性质与危害 6
二、分析方法 8
第三节 扩展青霉 9
一、概述 9
二、检测方法 11
第四节 PCR技术应用概述 12
一、PCR技术的原理 12
二、PCR检测技术的发展 15
三、PCR技术在微生物检测领域的应用 17
第五节 真菌DNA提取 21
第六节 克隆测序 22
一、感受态细胞的制备 22
二、蓝白筛选的原理 23
三、电泳的原理 24
第七节 本研究的目的、意义、内容及技术路线 24
一、研究目的及意义 24
二、研究内容 25
三、研究的技术路线 25
第二章 扩展青霉基因组DNA的提取 26
第一节 材料与方法 27
一、试验菌株与培养基 27
二、主要试剂 27
三、主要仪器 27
四、菌体培养与收集 28
五、DNA提取方法 28
六、DNA检测方法 30
七、PCR扩增方法 31
八、凝胶电泳检测方法 31
第二节 结果与分析 31
一、培养方式的选择 31
二、五种提取扩展青霉基因组DNA方法的比较 32
三、五种提取方法所提DNA结果的比较 33
四、电泳检测所提DNA的结果 34
五、PCR扩增结果 34
第三节 结论与讨论 35
第三章 腐烂苹果中的真菌分离与鉴定 37
第一节 材料与方法 37
一、材料与试剂 37
二、仪器与设备 37
三、方法与步骤 38
第二节 结果与分析 38
一、棒曲霉素产生菌的主要种类 38
二、不同产地腐烂苹果中棒曲霉素产生菌的差异 43
第三节 结论与讨论 44
第四章 基于氯化苄法提取DNA的PCR检测扩展青霉方法优化 45
第一节 材料与仪器 45
一、主要原材料 45
二、主要试剂 46
三、主要仪器设备 46
第二节 方法与步骤 46
一、引物选择 46
二、退火温度的优化 47
三、引物浓度的选择 47
四、模板浓度的选择 47
第三节 结果与分析 48
一、引物的选择 48
二、退火温度 48
三、引物浓度优化结果 49
四、模板浓度 50
五、特异性 50
六、灵敏性检测结果 51
第四节 结论与讨论 52
第五章 PCR扩增产物的克隆测序 53
第一节 材料与仪器 53
一、主要试剂 53
二、主要仪器设备 54
第二节 方法与步骤 54
一、感受态细胞的制备 54
二、PCR扩增产物回收纯化 55
三、克隆质粒的构建 55
四、转化感受态细胞 55
五、质粒DNA制备 56
六、质粒的双酶切鉴定 57
七、测序 57
第三节 结果与分析 57
一、转化结果 57
二、阳性克隆鉴定结果 58
三、测序与BLAST结果 58
第四节 结论与讨论 60
第六章 扩展青霉3.3703基因组DNA快速提取 61
第一节 材料与方法 61
一、材料与试剂 61
二、仪器与设备 62
三、方法与步骤 63
四、提取DNA的纯度及浓度检测 65
五、PCR扩增 65
六、凝胶电泳检测 65
第二节 结果与分析 66
一、四种方法提取DNA纯度及浓度检测结果 66
二、四种方法提取总DNA样品检测结果 67
三、PCR扩增检测结果 67
第三节 结论与讨论 68
第七章 PCR特异性扩增扩展青霉3.3703和扩展青霉3.5425 69
第一节 材料与方法 69
一、材料与试剂 69
二、仪器与设备 71
三、方法与步骤 72
第二节 结果与分析 75
一、PCR扩增引物筛选结果 75
二、PCR引物特异性试验结果 76
三、PCR敏感性试验结果 77
第三节 结论与讨论 78
第八章 扩展青霉3.5425实时PCR快速检测条件优化 79
第一节 材料与方法 79
一、材料与试剂 79
二、仪器与设备 79
三、方法与步骤 80
第二节 结果与分析 81
一、退火温度对扩展青霉3.5425实时PCR结果的影响 81
二、引物浓度对扩展青霉3.5425实时PCR检测的影响 81
三、实时PCR灵敏度检验 81
第三节 结论与讨论 91
第九章 PCR快速检测不同来源扩展青霉的条件优化 92
第一节 材料与方法 92
一、材料与试剂 92
二、主要仪器与设备 93
三、方法与步骤 94
第二节 结果与分析 97
一、PCR退火温度优化结果 97
二、最适引物浓度的筛选 97
三、最适模板浓度的筛选 98
四、最适底物浓度的选择 99
五、优化参数条件下的PCR检测 99
六、人工感染样品的PCR检测 100
第三节 结论与讨论 100
参考文献 102