第一篇 基因的基础理论 3
第一章 基因与基因工程概论 3
第一节 基因概念的发展 3
一、基因学说 3
二、DNA是遗传信息的载体 3
三、基因与顺反子 5
四、基因在DNA顺序上的多样性 6
五、基因的移动性 6
六、基因及其产物 7
第二节 基因工程 9
一、基因工程及其基本内容 9
二、基因工程问世后的社会反应 11
三、基因工程与医学 12
第二章 基因组的结构 16
第一节 基因的基本结构和命名 16
一、基因的基本结构 17
二、基因的命名 17
第二节 原核生物基因组 18
二、复制有关的结构 19
一、原核生物基因组的结构特点 19
三、转录有关的结构 20
四、翻译相关的结构 23
第三节 真核生物基因组 24
一、真核生物基因组的特征性结构 24
二、复制有关的结构 31
三、转录有关的结构 32
五、人类基因组计划 35
四、翻译有关的结构 35
第四节 病毒基因组 36
一、病毒基因组的结构特点 36
二、动物DNA病毒 36
三、动物DNA病毒 38
第五节 染色体外DNA 43
一、质粒DNA 43
二、细胞器DNA 44
第一节 基因的转移 46
一、细菌的接合 46
第三章 基因的转移和重组 46
二、细菌的转化 49
三、转导 50
四、转染 51
五、转座 51
第二节 基因的遗传重组 57
一、同源重组 58
二、非同源重组 60
一、操纵子水平的转录调控 62
第四章 基因表达的调控 62
第一节 原核生物的基因表达调控 62
二、色氨酸操纵子中的弱化子——基因转录的翻译调控 65
三、其他调节方式 67
第二节 真核生物的基因表达调控 71
一、真核生物基因表达调控的特点 71
二、真核生物基因表达调控的基本方式 72
二、限制性内切酶的识别特点 85
一、限制性内切酶的命名方法 85
第一节 限制性内切酶 85
第二篇 基因操作的相关技术 85
第五章 工具酶及其应用 85
三、限制性内切酶的切割方式 86
四、识别位点与切割方式之间的关系 86
五、限制酶产生的末端的连接 86
六、内切酶反应的影响因素 87
七、内切酶的星号活性 87
第二节 其他工具酶 88
一、DNA聚合酶 88
八、限制酶在分子克隆中的应用 88
二、T4噬菌体DNA连接酶 90
三、T4多聚核苷酸激酶 90
四、碱性磷酸酶 90
五、核酸酶 91
第六章 基因工程载体及其选用 92
第一节 质粒 92
一、质粒的一般特性 92
二、组建理想质粒载体必须具备的条件 94
三、常用的质粒载体 95
一、λ噬菌体 100
第二节 噬菌体类 100
二、λ噬菌体载体 101
三、λDNA的体外包装 102
四、粘粒 103
五、M13噬菌体 103
第三节 酵母质粒 103
一、酵母2μm质粒的生物学特性 103
二、酵母质粒DNA的提取和纯化 104
三、酵母细胞的基因克隆载体 104
四、酵母人工染色体 105
第四节 哺乳动物细胞表达载体 106
一、理想的哺乳动物细胞表达载体的结构特点 106
二、哺乳动物细胞表达载体 108
三、影响外源基因表达的因素 109
第五节 常用的真核病毒载体 109
一、猴空泡病毒 109
二、牛痘病毒 111
三、腺病毒 112
四、逆转录病毒 114
一、聚合酶链反应原理 116
第七章 聚合酶链反应 116
第一节 聚合酶链反应及其反应条件的优化 116
二、Taq DNA聚合酶简化并推动了PCR的发展 117
三、各种来源的DNA都可作PCR扩增的模板 118
四、PCR的特异性、效率和忠实性 119
二、原位PCR 120
三、多重PCR 120
四、定量PCR 120
一、套式PCR 120
第二节 常用聚合酶链反应技术 120
五、RNA PCR 121
六、PCR测序 121
第八章 已知序列基因的克隆 124
第一节 外源DNA片段的获得 124
第二节 目的DNA片段的克隆 125
一、目的DNA片段与载体的连接 125
二、重组DNA分子转入宿主细胞的方式 126
第三节 重组子的筛选与鉴定 127
二、根据重组子的结构特征筛选 128
一、针对遗传表型的变化筛选 128
第四节 目的基因的确定及分析DNA序列测定 130
一、概述 130
二、末端终止法 130
三、化学裂解法 131
四、DNA序列测定自动化 132
第九章 未知序列基因的克隆 133
第一节 基因克隆和分离的三个步骤 133
一、选择含目的基因的实验材料 133
二、选择合适的方法制备DNA片段并使之克隆 134
三、选择合适方法筛选目的基因 135
第二节 cDNA克隆 135
一、cDNA合成 135
二、cDNA克隆 136
第三节 目的cDNA克隆的筛选 137
一、用核酸探针筛选目的cDNA 137
二、用寡核苷酸探针筛选目的cDNA 138
三、差示筛选组织特异的cDNA 142
四、用抗体筛选目的cDNA 142
五、功能结合法筛选目的cDNA 145
第四节 目的DNA的结构及功能分析 148
一、目的cDNA的结构分析 148
二、cDNA产物的功能分析 148
第十章 基因克隆策略新进展 152
第一节 基于生物大分子间相互作用的cDNA克隆策略 152
一、噬菌体显示法与功能结合法的联合应用 152
二、酵母双杂交系统 152
三、酵母单杂交系统 155
四、三杂交系统 155
五、反向双杂交系统和反向单杂交系统 156
六、哺乳动物细胞双杂交系统和细菌双杂交系统 157
第二节 比较并克隆组织或细胞间差异表达基因cDNA的策略 157
一、差别显示反转录PCR 157
二、基于PCR的递减杂交技术 158
第三节 表型相关基因组基因的克隆策略 160
一、基因组错配技术 160
二、代表性差异分析 160
第四节 生物信息及其在人类基因组研究中的应用 162
三、大规模基因功能表达谱的分析 163
二、完整基因组的比较研究 163
一、新基因的克隆与功能分析 163
四、生物大分子的结构模拟与药物设计 164
五、非编码区信息结构分析 164
六、遗传密码起源和生物进化的研究 164
第十一章 体外突变 166
第一节 随机突变 166
一、限制性内切酶法 166
二、接头插入法 168
三、系列缺失法 169
四、接头扫描突变法 171
五、核苷酸随机取代法 171
第二节 定点突变 174
一、寡核苷酸诱导的定点突变法 174
二、寡核苷酸诱导的盒式突变法 177
三、全基因合成法 177
四、PCR突变法 178
二、改变种属特异性 180
三、增高蛋白质的专一性 180
一、提高蛋白质的生物活性及稳定性 180
第三节 定点突变与蛋白质工程 180
第十二章 外源基因表达系统 182
第一节 大肠杆菌表达系统 182
一、大肠杆菌表达的特点 182
二、外源基因在原核细胞中表达的重要调控元件 182
三、真核基因在大肠杆菌中表达的形式 187
四、大肠杆菌表达系统的问题 188
第二节 酵母表达系统 188
一、酵母表达系统的特点 188
二、啤酒酵母表达系统 189
三、毕赤酵母表达系统 191
第三节 昆虫细胞表达系统 195
一、昆虫细胞的表达载体 195
二、昆虫细胞宿主 195
三、重组病毒载体的转染 196
四、分泌性表达 197
五、缺点 197
第四节 哺乳类细胞表达系统 197
一、常用的增强子——启动子 198
三、重组载体导入受体细胞的方法 201
二、宿主细胞 201
四、缺点 202
第十三章 转基因动物 203
第一节 转基因动物的原理 203
一、转基因与转基因动物 203
二、转基因技术的发展史 203
三、转基因动物的原理 204
第二节 转基因动物遗传修饰的策略及其发展 204
一、导致产生新功能的基因组修饰 204
四、染色体畸变 205
三、导致基因替换的基因组修饰 205
二、导致功能缺失的基因组修饰 205
第三节 转基因动物的构建 206
一、转基因动物技术体系的组成 206
二、外源基因的构建 207
三、建立转基因动物的途径 207
第四节 转基因动物的检测 211
一、染色体及基因水平的检测 211
二、转录水平的检测 211
第五节 转基因动物的命名 212
三、蛋白质水平的检测 212
二、转基因动物命名法则 213
一、转基因动物命名的要求 213
第六节 转基因动物研究中存在的问题 214
一、转基因动物的效率 214
二、外源基因的整合造成宿主的基因突变 214
三、外源基因的表达 214
四、动物模型的表型与预期的不同 215
第一节 酶谱分析法 219
一、直接分析法 219
第十四章 基因诊断 219
第三篇 基因工程在医学中的应用 219
二、间接分析法 220
第二节 探针杂交分析法 220
一、寡聚核苷酸探针分析法 220
二、基因芯片 222
第三节 PCR为基础的诊断技术 224
一、PCR-单链构象多态性 224
二、PCR-变性梯度凝胶电泳 225
第一节 概述 226
第十五章 基因工程抗体 226
第二节 鼠单抗的人源化 227
一、恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体 227
二、可变区的人源化 227
三、通过抗体库技术获得完全人源化的抗体 228
一、小分子抗体 229
二、抗体融合蛋白 229
第四节 噬菌体抗体库技术 230
一、原理 231
二、基本技术 231
三、应用和展望 233
第五节 基因工程抗体的现状与展望 233
第十六章 基因因工程药物 235
第一节 表达系统特点和选择原则*2 235
第二节 基因工程药物 236
一、激素类及神经递质类药物 236
二、细胞因子类药物 238
三、酶类药物及凝血因子 240
第十七章 基因治疗 242
第一节 基因治疗历史与现状 242
第二节 基因转移的方法 245
一、基因转移的物理方法 245
二、基因转移的化学方法 245
三、基因转移的生物方法 246
第三节 基因治疗的靶细胞 250
一、造血干细胞 250
二、成纤维细胞 251
三、肝细胞 251
四、肌细胞 252
五、淋巴细胞 252
第四节 基因治疗的应用 252
一、遗传病的基因治疗 253
二、恶性肿瘤的基因治疗 253
三、病毒性感染的基因治疗 255
第五节 问题与展望 256
三、免疫原性 257
四、伦理问题 257
二、稳定性 257
一、安全性 257
第十八章 基因工程疫苗 259
第一节 基因工程活疫苗 259
一、基因缺失活疫苗 260
二、基因工程活载体疫苗 260
第二节 基因工程亚单位疫苗 261
第三节 表位靶向的合成疫苗 262
一、合成肽疫苗 262
二、T细胞疫苗 262
第四节 核酸疫苗 263
一、免疫方法和机制 264
二、研究进展 265
第四篇 基因工程基本实验 271
实验一 质粒的小量提取 271
实验二 大规模制备质粒DNA——碱变性法 274
实验三 紫外吸收检测DNA的浓度与纯度 276
实验四 溴化乙锭——标准DNA浓度比较法测定DNA浓度 277
实验五 基因的PCR扩增技术 278
实验六 逆转录PCR扩增目的基因 281
实验七 DNA的限制性内切酶酶切及电泳 283
实验八 DNA片段回收及连接 287
实验九 感受态细胞的制备及重组DNA转化大肠杆菌 290
实验十 重组DNA的快速制备和鉴定 293
实验十一 DNA探针制备 296
第三节 小分子抗体和抗体融合蛋白 297
实验十二 菌落(噬菌斑)原位杂交 298
实验十三 Southern印迹杂交 301
实验十四 Northern印迹杂交 304
实验十五 大肠杆菌发酵技术 307
实验十六 离子交换层析 311
实验十七 亲和层析 315
实验十八 凝胶过滤层析 318
实验十九 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 320
实验二十 蛋白印迹分析 325
实验二十一 蛋白质浓度的测定 328
实验二十二 蛋白质等电点测定 331
附表1 1982～1998年美国获准上市生物高技术药物和疫苗一览表 332
附表2 国内预防、诊治、治疗用医药生物技术产品研究开发进展 334