第一部分 基本知识 1
第一章 光的基本知识 3
一、光的本质 3
二、光的性质 3
三、光的吸收 5
第二章 荧光的基本知识 6
第一节 荧光的发光原理 6
一、荧光 6
二、荧光的发光原理 7
三、荧光色素及其大分子结构 8
第二节 荧光色素的性质 9
一、激发光波长和发射光波长 9
二、激发光谱和发射光谱 10
三、荧光强度 12
四、荧光寿命 12
五、荧光稳定性 13
六、荧光色素分子间的相互作用 13
七、荧光色素分子对环境的敏感性 14
八、荧光色素的分类 14
第三节 组织细胞的自发荧光与继发荧光 15
一、组织细胞的自发荧光 15
二、组织细胞的继发荧光 17
第四节 荧光的淬灭及抗淬灭 18
一、荧光的淬灭 18
二、荧光的抗淬灭 19
三、其他抗荧光淬灭方法 22
第五节 荧光光谱交叉干扰及消除 22
第三章 荧光染料（色素）的早期应用和发展史 26
一、染料的早期应用和发展 26
二、荧光染料（色素）的早期应用和发展 27
三、荧光染料（探针）在活细胞中的早期应用和发展 28
四、荧光染料（探针）在植物研究中的早期应用和发展 29
第四章 常用的荧光染料（探针） 32
第一节 细胞器荧光探针 32
一、线粒体荧光探针 32
二、溶酶体荧光探针 34
三、内质网荧光探针 34
四、高尔基复合体荧光探针 36
第二节 细胞骨架荧光探针 37
一、F-肌动蛋白荧光探针 37
二、G-肌动蛋白荧光探针 39
三、微管蛋白荧光探针 39
四、微管选择性的紫杉醇探针 40
第三节 研究钙调节及活性的荧光探针 41
一、钙调蛋白荧光探针 41
二、蛋白激酶C的荧光探针 41
三、钙离子的荧光探针 42
第四节 核酸荧光探针 44
一、透性核酸荧光探针 44
二、非细胞透性核酸荧光探针 48
第五节 其他荧光探针 52
一、D1和D5多巴胺受体荧光探针 52
二、表皮生长因子受体（EGF）荧光探针 52
三、甘氨酸受体荧光探针 53
四、组织胺受体探针 53
第五章 活体荧光材料——绿色荧光蛋白（GFP）及其衍生物 57
一、发现绿色荧光蛋白 57
二、绿色荧光蛋白的结构 57
三、绿色荧光蛋白的特性及优点 59
四、荧光蛋白的新进展 61
第六章 最新型荧光材料——量子点 64
一、量子点的定义及物理特性 64
二、量子点具有优良的光学特性 66
三、量子点的优点 66
四、量子点技术在生物领域中的应用 66
五、量子点技术的安全性 69
六、量子点技术的发展前景 70
第二部分 荧光色素（探针）在细胞生物学中的应用 71
第七章 荧光技术在细胞凋亡研究中的应用 73
第一节 细胞凋亡及其基本通路 74
一、细胞凋亡 74
二、细胞凋亡的基本转导通路 75
第二节 荧光显微镜对细胞凋亡的形态学观察 78
一、通过光学显微镜对凋亡细胞的形态学的观察 78
二、通过电子显微镜对凋亡细胞的形态学的观察 78
三、通过荧光显微镜对凋亡细胞的形态学的观察 79
四、通过某些特定分子在细胞凋亡时定位的变化对其进行荧光标记 80
第三节 凋亡调控分子的荧光标记在细胞凋亡研究中的应用 80
一、荧光显微镜在对Survivin及其剪接体参与的细胞凋亡研究中的应用 81
二、荧光显微镜在促凋亡蛋白RIP3核质穿梭性鉴定中的应用 85
第四节 其他荧光技术在细胞凋亡研究中的应用 87
一、Caspase活性的荧光检测 87
二、蛋白表达调控元件活性的萤光检测 89
第八章 流式细胞术在细胞生物学中的应用 94
第一节 检测细胞的特征 94
一、表型的分析 94
二、胞内蛋白的检测 96
第二节 检测细胞的增殖和凋亡状态 101
一、用PI染色法分析细胞的增殖和凋亡 101
二、检测细胞凋亡PI和Annexin-Ⅴ 103
第三节 定量检测可溶性蛋白质（CBA技术） 105
第四节 纯化特定的细胞 109
一、原理 109
二、方法 109
三、预期结果 109
四、注意事项 110
第九章 荧光在细胞骨架研究中的应用 111
第一节 荧光技术在微丝骨架研究中的应用 112
一、概述 112
二、胃壁细胞酸分泌过程中的微丝骨架蛋白研究 113
三、材料与方法 120
第二节 荧光技术在微管骨架研究中的应用 121
一、概述 121
二、有丝分裂过程中微管形态与功能的研究 123
三、观察Hela细胞中微管和ACA蛋白的定位 131
第十章 荧光原位杂交 132
第一节 荧光原位杂交的基本原理与基本过程 132
一、荧光原位杂交的基本原理 132
二、荧光原位杂交的基本实验过程 132
三、FISH技术新进展 143
第二节 荧光原位杂交的应用 145
一、基因定位 145
二、染色体物理图谱构建 146
三、染色体结构分析 147
四、染色体数目测定 148
五、研究染色体进化／比较基因组学 148
六、转基因的细胞学鉴定 149
七、基因表达分析和临床病毒学检测 149
第十一章 荧光在HER2/ErbB2/p185研究中的应用 150
第一节 用免疫荧光细胞化学的方法鉴定抗体与p185的结合特异性 151
一、材料与方法 151
二、结果 152
第二节 EGFP在ErbB2胞内区核定位信号研究中的应用 152
一、材料 153
二、方法 154
三、结果 157
第十二章 绿色荧光蛋白（GFP）在细胞分子生物学中的应用 162
第一节 绿色荧光蛋白（GFP）在动物细胞分子生物学中的应用 162
一、探测细胞的流程 162
二、确定细胞器的定位 163
三、研究细胞骨架 163
四、作为基因表达和细胞谱系的标记 163
五、研究蛋白质之间的相互作用和构象变化 164
六、研究细胞内信号传导 164
七、亚细胞动力学研究 164
八、研究细胞凋亡 165
九、检测细菌 165
十、转基因动物 165
第二节 绿色荧光蛋白（GFP）在植物细胞和分子生物学中的应用 166
一、植物细胞骨架研究 166
二、细胞器动力学和内膜运输 167
三、大分子运输和病毒在植物体内的运动 168
四、植物与微生物之间的相互作用 169
五、会发荧光的植物“哨兵” 169
六、GFP在植物分子生物学研究中的应用 169
第十三章 免疫荧光细胞化学技术 172
第一节 免疫学基础知识 172
一、抗原、抗体的概念及抗原和抗体的关系 173
二、抗原的性质及种类 173
三、抗体的性质和种类 175
四、抗原与抗体的反应 176
第二节 免疫荧光细胞化学的原理 176
一、直接法 177
二、间接法 177
三、双重免疫荧光标记法 178
四、对照试验 178
第三节 荧光抗体的制备 179
一、FITC标记抗体的方法 179
二、荧光抗体的保存 181
第四节 免疫荧光组织化学细胞和组织标本的制备 181
一、组织标本的取材 181
二、细胞和组织的固定 182
三、组织切片 185
四、玻片处理和涂胶 187
第五节 免疫荧光细胞化学染色方法 188
一、标本制作 188
二、荧光抗体染色方法 188
第六节 非特异性染色的消除方法 191
一、非特异性染色的主要因素 191
二、除非特异性染色的方法 191
第三部分 常用荧光检测仪器 195
第十四章 生物荧光显微镜 197
第一节 普通生物光学显微镜 197
一、显微镜的构造 198
二、显微镜的成像原理 200
三、显微镜的性能 201
四、显微镜的操作及注意事项 203
五、相差显微镜 204
六、微分干涉差显微镜 205
七、暗视野显微镜 206
第二节 生物荧光显微镜 206
一、荧光显微镜的分类及主要组成部分 208
二、荧光显微镜落射式照明原理 210
三、荧光显微镜的基本操作及注意事项 211
第三节 细胞遗传工作站 213
一、细胞遗传工作站的组成 213
二、细胞遗传工作站的应用 214
三、细胞遗传工作站的工作原理 214
四、基本操作 214
第十五章 激光扫描共聚焦显微镜 222
第一节 基本原理 223
第二节 主要部件 224
一、激光器 225
二、扫描器 226
三、荧光显微镜 227
四、计算机 227
第三节 操作步骤及注意事项 228
一、样品制备 228
二、基本观察步骤及仪器操作 229
三、获取3D图像 230
四、获取时间序列图像 230
第四节 主要用途 231
一、细胞物理和生物化学测定 231
二、激光扫描共聚焦图像分析及三维重组分析生物结构 231
三、动态荧光测定 231
四、荧光光漂白恢复——活细胞的动力学参数 232
五、胞间通讯研究 232
六、检测荧光共振能量转移 232
七、细胞膜流动性测定 232
八、笼锁-解笼锁测定 233
九、粘附细胞分选 233
十、细胞激光显微外科及光陷阱技术 233
十一、生物芯片（biochip） 233
第五节 LSM 510 META 234
一、LSM 510 META的扫描模件 234
二、LSM 510 META的优点 234
三、LSM 510 META的操作过程 236
第六节 其他用途 236
一、FRAP/FLIP 236
二、FRET 237
第七节 应用于激光共聚焦的新技术 239
一、TIRFM 239
二、多扫描模块系统 241
三、弧光灯光源的圆盘扫描系统 241
第八节 双光子（多光子）激光扫描显微镜 242
一、单光子激光扫描共聚焦显微镜的局限 242
二、双光子（多光子）激光理论基础 242
三、双光子（多光子）激光成像原理 243
四、双光子共聚焦显微镜的优点 243
第九节 注意事项及维护保养 244
第十六章 活细胞显微成像技术 245
第一节 活细胞荧光工作站 245
一、荧光激发和显微成像系统 246
二、图像信号采集系统 249
三、环境控制系统 249
四、光损伤控制系统 250
五、计算机控制和信号处理系统 250
第二节 其他活细胞显微成像技术 251
一、全内反射显微镜技术 251
二、荧光相关光谱技术 253
三、荧光共振能量转移技术 253
第十七章 活体体内荧光成像技术 255
一、基本原理 255
二、基本组成 256
三、实验过程 257
四、系统特性 258
五、应用 261
六、发展前景 263
第十八章 流式细胞仪 264
第一节 概述 264
第二节 工作原理与基本构成 266
一、工作原理 266
二、基本构成 266
第三节 主要用途 270
一、细胞周期和DNA倍体分析 270
二、细胞凋亡与坏死的检测 270
三、染色体分析 271
四、细胞表面标志的检测 271
五、淋巴细胞亚群分析 271
六、胞内蛋白的检测 271
七、细胞的分选 272
第四节 检测样品的制备 272
一、直接标记细胞表面分子 272
二、检测细胞内信号分子 272
三、用PI单染检测细胞周期 273
四、样品制备的注意事项 273
第五节 仪器的基本操作步骤 273
一、FAcs Calibur 273
二、FAcs Aria 274
第六节 重要参数及意义 275
一、前向散射光（FSC） 275
二、侧向散射光（SSC） 276
三、荧光信号 276
四、补偿值 277
五、使用双色补偿质控样本，微调补偿 278
第七节 数据处理与分析 278
一、流式的实验数据主要有以下几种形式 278
二、数据分析 280
第十九章 荧光定量PCR仪 281
第一节 概述 281
第二节 基本原理 282
一、荧光定量化学原理 282
二、荧光定量PCR仪的光学原理 284
三、荧光定量原理 285
第三节 仪器介绍 286
第四节 样品制备及操作步骤 289
一、DNA用量 289
二、TaqMan探针法PCR 289
三、SYBR Green I荧光染料法PCR 290
四、ABI Prism7000 SDS v1.0软件操作 290
第二十章 荧光分光光度计 292
一、基本结构与原理 292
二、AMINCO-Bowman扫描荧光分光光度计 293
三、基本操作 296
第二十一章 激光扫描成像仪 298
一、系统硬件组成及功能 298
二、工作原理及操作步骤 298
三、仪器参数 299
四、荧光样品的制备 299
附录 免疫细胞化学常用试剂及其配制方法 301
第一节 缓冲液 301
一、0.2mol/L（pH 7.4）磷酸缓冲液（phosphate buffer,PB） 301
二、0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水（phosphate buffered saline,PBS） 302
三、Karasson-Schwlt磷酸盐缓冲液 302
四、0.5mol/L(pH 7.6)Tris-HCl缓冲液 303
五、Tris缓冲生理盐水（Tris buffered saline,TBS） 303
六、Tris-TBS(PBS) 303
七、0.1mol/L（pH 7.4）二甲胂酸钠缓冲液 304
八、几种常用的不同pH值缓冲液的配制表 304
第二节 固定剂 306
一、4％多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.3） 306
二、4％多聚甲醛-磷酸二氢钠／氢氧化钠 306
三、Bouin液及改良Bouin液 307
四、Zamboni（stefanini）液 307
五、PLP液（periodate-lysine-paraformaldehyde fixative过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液） 307
六、Karnovsky液（pH 7.3） 308
七、0.4％对苯醌（parabenzoquinone） 308
八、PFG液（parabenzoqulinone-formaldehyde-gutaraldehyde fixative） 309
九、碳二亚酰胺-戊二醛（ECD-G）液 309
第三节 粘附剂 310
一、铬矾明胶液 310
二、甲醛-明胶液 310
三、多聚赖氨酸（poly-l-lysine,PLL） 311
四、Vectabond试剂 311
第四节 封固剂 311
一、甘油-TBS及甘油-PBS 311
二、甘油-明胶（冻） 312
三、液体石蜡 312
四、DPX 312
五、抗荧光淬灭剂 312
第五节 其他辅助试剂 312
一、蔗糖溶液 312
二、Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚） 313
三、甲醇-H2O2液 314
参考文献 315