第1章 目的基因的分离 1
1.1 植物组织DNA的提取 1
1.1.1 植物组织总DNA的提取 2
1.1.2 植物细胞核DNA的提取 6
1.1.3 植物细胞叶绿体DNA的提取 7
1.1.4 植物细胞线粒体DNA的提取 10
1.2 植物组织RNA的提取 12
1.2.1 植物组织总RNA的提取 12
1.2.2 mRNA的分离纯化 14
1.3 目的基因的PCR扩增 18
1.3.1 mRNA差别显示技术 19
1.3.2 抑制性扣除杂交技术 23
1.3.3 保守序列PCR克隆技术 27
参考文献 29
第2章 载体构建 31
2.1 扩增体系建立 31
2.1.1 大肠杆菌质粒DNA的提取 31
2.1.2 DNA的限制性内切酶消化 34
2.1.3 DNA片段的纯化回收 35
2.1.4 目的基因与载体的连接 37
2.1.5 重组质粒DNA转化大肠杆菌 39
2.1.6 重组质粒细胞菌落的鉴定 43
2.2 植物遗传转化载体构建 44
2.2.1 根癌农杆菌Ti质粒DNA的提取 44
2.2.2 Ti质粒转化载体的构建 46
2.2.3 发根农杆菌Ri质粒DNA的提取 47
2.3 组织特异性表达载体的构建 48
2.3.1 组织特异性启动子与质粒DNA的酶切及回收 48
2.3.2 组织特异性启动子与载体DNA片段的连接 50
参考文献 50
第3章 目的基因的转化 51
3.1 农杆菌转化法 51
3.1.1 烟草农杆菌叶盘转化 52
3.1.2 拟南芥花序浸润转化 55
3.1.3 水稻愈伤组织农杆菌转化 56
3.1.4 发根农杆菌转化 58
3.2 基因枪转化法 59
3.2.1 小麦幼胚基因枪转化 60
3.2.2 叶绿体遗传转化 62
3.3 电穿孔法 66
3.4 PEG介导的基因转化法 68
参考文献 71
第4章 转基因植物的鉴定 73
4.1 标记基因的检测 73
4.1.1 gus基因检测 74
4.1.2 bar基因的检测 80
4.1.3 GFP的检测 83
4.2 目的基因的整合鉴定 83
4.2.1 Southern印迹杂交 83
4.2.2 RT-PCR 96
4.2.3 Northern杂交 98
4.2.4 荧光原位杂交（FISH） 107
4.3 基因的表达分析 112
4.3.1 SDS-PAGE分析 112
4.3.2 Western印迹 114
参考文献 116
第5章 转基因植物的基因安全评价 117
5.1 转基因小麦环境释放中花粉介导的基因漂移检测 117
5.2 土壤微生物群落的检测 120
5.3 转基因食品的毒理学评价 122
5.3.1 急性毒性试验 123
5.3.2 微核实验 124
5.3.3 30天和90天喂养试验 125
5.3.4 慢性毒性和致癌试验 127
参考文献 128
第6章 计算机在植物基因工程研究中的应用 131
6.1 生物学相关软件 131
6.1.1 Primer 131
6.1.2 RasMol 2.6 135
6.1.3 DNAStar 137
6.1.4 进化树的软件 139
6.2 生物学实用网站 142
参考文献 144
附录 145
附录1 主要溶液（母液）及缓冲液的配制 145
附录2 常用培养基的配制 150
附录3 常用抗生素的配制及使用浓度 152
附录4 凝胶浓度的有效分离范围 152
附录5 常用的相对分子质量标准 153
附录6 核酸的量与质量间的换算 156