制备方法 3
手摇法制备多层脂质体 5
超声法制备脂质体 6
冻干再水化脂质体（FRV）制备过程中包封标记转铁蛋白 8
逆相蒸发法制备脂质体 9
以交叉过滤法去除表面活性剂制备脂质体 12
挤出法制备脂质体 94
脂质体的纯化 19
凝胶过滤法分离蛋白脂质体 20
分离REV蛋白脂质体中未结合的蛋白质 21
微柱离心法分离脂质体与低分子质量物质 21
脂质体组分的化学分析 25
Bartlett法测定无机磷酸盐 26
Stewart法测定磷脂 27
脂质的TLC 28
（磷）脂的HPLC分析 31
胆固醇和α-生育酚的HPLC分析 33
脂肪酸的GC分析 35
UV吸收法测定共轭二烯和三烯 36
TBA法测定内过氧化物 37
碘量法测定氢过氧化物 38
脂质体的物理表征 40
微柱离心法 41
鱼精蛋白聚集法 42
偶氮砷Ⅲ法测定释放率 45
羧基荧光素脂质体的制备和应用 48
含葡萄糖脂质体的制备和应用 49
其他方法 57
Bligh和Dyer萃取法 57
Sep-Pak微柱萃取 58
羧基荧光素溶液的配制 59
钙黄绿素溶液的配制 60
DSC测量的实际问题 66
脂质体的DSC研究 68
脂质体的HSDSC研究 69
冻干脂质体的MTDSC研究 71
荧光分析法研究脂质体融合 81
测定脂质体水性内容物混合的铽／二吡啶羧酸分析法 82
逆相蒸发法制备大单层脂质体 84
小单层脂质体的制备 85
磷酸盐分析法测定融合分析用脂质体的磷脂浓度 86
ANTS/DPX融合分析 87
N-NBD-PE/N-Rh-PE RET分析法测定膜融合过程的脂质混合 89
荧光分析测定内侧单分子层的混合 91
荧光法检测蛋白质与磷脂膜的结合 93
蛋白质结合引起的芘单体荧光强度变化的测定 94
挤出法制备脂质体 94
色氨酸淬灭实验 96
脂质体作为pH传感器研究细胞相互作用 97
将Pyranine包封于脂质体中用作细胞摄取的探针 98
荧光分光光度法研究脂质体的细胞摄取 99
荧光显微法研究脂质体的细胞摄取 101
用脂质体双荧光团法测定细胞内pH 103
双光子激发荧光显微法检测巨大型脂质体中的脂质相 104
巨大型单层脂质体（GUV）的制备 106
脂质体的冻干 120
脂质体的冻干 126
磷脂浓度的测定 130
磷酸盐分析法测定磷脂浓度 131
用确定孔径的聚碳酸酯膜挤出制备大单室脂质体 132
挤出法制备LUV［DSPC/Chol,（55∶45）］ 132
弱碱性药物基于跨膜pH梯度在LUV中积聚 133
弱碱性药物（如阿霉素）主动载入具跨膜pH梯度的LUV 135
弱碱性药物（如环丙沙星）主动载入具跨膜铵梯度的LUV 137
弱碱性药物（如长春新碱）经离子载体-介导而载入具跨膜离子梯度的LUV 139
包封基因药物的脂质体系统：用于体内递送基因和反义寡核苷酸的长循环载体 140
通过表面活性剂透析法将质粒DNA包封入稳定的质粒-脂质粒子（SPLP） 141
通过聚核苷酸“乙醇-依赖”摄入预制囊泡工艺将反义寡核苷酸包封入稳定的反义-脂质粒子（SALP） 144
蛋白质和多肽连接到脂质体表面 149
用酸酐对PE进行衍生化 151
心肌磷脂的衍生化 152
有表面活性剂存在下，用NGPE对抗体进行疏水化，再通过透析法将其插入脂质体 153
无表面活性剂存在下，用PE或CL酰基衍生物对蛋白质进行疏水化，再将其插入REV脂质体 153
蛋白质固定于含有NGPE的预制脂质体表面 155
将水溶性多肽共价偶联到脱水-再水化脂质体上 155
脂质体的高碘酸盐偶联法 156
N-PDP-PE的合成 158
蛋白质的巯基化（以IgG为例说明） 159
影响偶联反应效率的因素 160
SAMSA/SATA修饰蛋白质 164
将碳水化合物（糖）或其他小分子结合于脂质体表面 166
将糖衍生物共价偶联于预制含NGPE的脂质体 167
脂质体结合糖的定量分析 168
将诊断用金属原子连接于脂质体表面 168
DTPA二硬脂酰酯的制备 169
DTPA二硬脂酰硫酯的制备 169
DTPA二硬脂酰胺的制备（在V.P.T.实验室完成） 170
DTPA磷脂酰乙醇胺（DTPA-PE）的制备 170
另一制备DTPA-PE的方法（在V.P.T.实验室完成） 171
多螯合聚合物的制备 171
在DTPA硬脂酰胺（DTPA-SA）上负载Gd 172
在DTPA硬脂酰酯（DTPA-SE）上负载Gd 174
在DTPA-PLL-NGPE上负载Gd（在V.P.T.实验室完成） 174
在含DTPA的脂质体上负载Gd 174
在含DTPA的脂质体上负载99mTc 175
用111In标记含螯合剂的脂质体（在V.P.T.实验室完成） 175
空间保护聚合物（PEG）与脂质体相连接 179
用PEG羟基琥珀酰亚胺酯制备PEG-PE 180
用PEG琥珀酸酯合成PEG-PE 180
用羰二咪唑合成PEG-PE 181
合成PEG-琥珀酸半胱酰胺，与含有间-马来酰亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺酯DPPE衍生物（MBPE）的预制脂质体表面连接 181
不同配体与脂质体中接技聚合物的远端相连 184
PE-PEG-酰肼（PEG-PE-Hz）的合成 188
将氮端为Ser或Thr的肽连接到脂质体中PE-PEG-Hz远端的酰肼基上 189
将经高碘酸氧化的抗体与含有Hz-PEG-PE的脂质体相连接 190
PDP-PEG-PE的合成 190
马来酰亚胺丁酸苯酯-抗体（MPB-Ab）的合成 191
抗体与含有PDP-PEG-PE的脂质体相连接 192
顺丁烯二酰亚胺-PEG-PE的合成 192
COOH-PEG-PE的合成 193
抗体与含有COOH-PEG-PE的脂质体相连 194
配体与pNP-PEG-PE相连 195
低聚糖（SLX）-PEG-DSPE的合成 196
Sialyl Lewisx(SLX)-PEG-DSPE的合成 196
寡肽（YIGSR）-PEG-DSPE的合成 197
氨基-PEG-DSPE的合成 199
叶酸-PEG2000-DSPE的合成 200
生物素-PEG-DSPE的合成 201
通过将混有配体脂质聚合物的脂质水化并挤出制备携有配体的脂质体（PHPC/胆固醇／mPEG-DSPE／配体-PEG-DSPE，物质的量比55∶40∶3∶2） 202
将配体-PEG-DSPE插入到预制脂质体中 202
脂质体表面上可解离的PEG 203
制备带有可解离PEG包衣的pH敏感脂质体 203
脂质体与细胞的相互作用 208
培养细胞对脂质体的结合和摄取 211
用胶原蛋白酶灌注法分离和纯化肝实质细胞、枯否细胞和内皮细胞 214
由大鼠肝分离的肝实质细胞、枯否细胞和内皮细胞的培养 216
脂质体的生物学分布 217
从血清中重新分离脂质体 218
大鼠体内脂质体组织分布的测定 220
大鼠器官内脂质体分布的定性测定 221
质粒DNA的分离 230
氯化铯离心法分离质粒DNA 230
质粒DNA浓度的定量 231
Hoechst荧光分析 232
紫外分光光度法测定质粒DNA的浓度 232
脂质转染（Lipofection） 233
方法 242
逆相蒸发-挤出法制备FITC-右旋糖酐pH敏感脂质体（DOPE/CHEMS,3∶2，物质的量之比，50mmol/L脂质，2mL） 242
采用冻融-挤出法制备HPTS或HPTS/DPX pH敏感脂质体（DOPE/CHEMS,3∶2物质的量之比；50mmol/L脂质，1mL） 243
pH敏感脂质体的稳定性 244
用显微技术或流式细胞仪分析研究pH敏感脂质体与细胞的结合 245
pH敏感脂质体的胞吞作用 246
γ-发射放射性核素标记脂质体的方法 252
谷胱甘肽-HMPAO后装法99mTc标记脂质体 254
图像采集和分析方法 257
动物静脉注射放射标记脂质体后的成像研究 258
以γ井型计数器测定组织生物学分布 260
放射标记脂质体静脉注射后在动物体内的组织生物学分布研究 260
临界胶束浓度的评价 268
表面活性剂的恒温微量滴定——CMC的测定 269
数据分析 269
表面活性剂-双分子层膜平衡 270
表面活性剂向膜内的分配 273
脂质体增溶 274
囊泡型磷脂凝胶的制备 278
用单一脂质制备VPG 278
用两种或多种脂质制备VPG 279
VPG的载药 280
亲水性化合物（吉西他滨）在VPG中的被动载药 280
VPG的表征 282
VPG药物的体外释放评价 283
由VPG制备SUV分散体 284
VPG转变为脂质体分散体 284
采用脱水-再水化法将质粒DNA包封于脂质体中 292
MLV和SUV的制备 293
脂质体包封质粒DNA 293
DNA包封率的评价 294
减少包封DNA的DRV脂质体粒径 295
Ⅰ 一般方法 1
第1章 脂质体的制备 3
1.1 磷脂的处理及贮存 3
1.2 制备方法 3
1.2.1 手摇法 3
1.2.2 超声法 5
1.2.3 冻干再水化法 7
1.2.4 逆相蒸发法 8
1.2.5 表面活性剂去除法 10
1.2.6 高压均质法 13
1.3 脂质体的纯化 19
1.3.1 柱过滤 19
1.3.2 离心法纯化脂质体 19
参考文献 22
第2章 脂质体的表征 24
2.1 引言 24
2.2 脂质体组分的化学分析 25
2.2.1 分光光度法对磷脂进行定量分析 25
2.2.2 脂质的薄层色谱 28
2.2.3 （磷）脂的HPLC分析 30
2.2.4 胆固醇和α-生育酚的HPLC分析 32
2.2.5 脂肪酸的GLC分析 33
2.2.6 脂质体磷脂降解的化学分析 35
2.3 脂质体的物理表征 40
2.3.1 包封百分比的测定 40
2.3.2 释放率的测定 43
2.3.3 包封体积的测定 51
2.3.4 层状结构 51
2.3.5 脂质体的粒径测定 53
2.3.6 PCS测定zeta电势 57
2.4 其他方法 57
2.4.1 Bligh和Dyer萃取法 57
2.4.2 Sep-Pak微柱萃取 58
2.4.3 羧基荧光素和钙黄绿素溶液的制备 59
参考文献 60
第3章 物理研究方法：差示扫描量热法 62
3.1 引言 62
3.2 技术概述 62
3.2.1 差示扫描量热法 62
3.2.2 高灵敏度差示扫描量热法 64
3.2.3 调制温度差示扫描量热法 64
3.3 DSC测量的实际问题 66
3.3.1 坩埚的选择 66
3.3.2 样品量 66
3.3.3 校准 66
3.3.4 扫描速率 67
3.3.5 研究脂质体要求的条件 67
3.3.6 HSDSC测量的实际应用 69
3.3.7 MTDSC测量实例 70
3.4 DSC及相关技术在脂质体研究中的应用 71
3.4.1 脂质体的相转变行为 71
3.4.2 多组分体系的相转变 73
3.4.3 磷脂-药物的相互作用 75
3.4.4 脂质体作为膜模型的DSC研究 77
3.4.5 冻干脂质体的MTDSC研究 78
致谢 78
参考文献 79
第4章 脂质体研究中的荧光分析法 81
4.1 荧光分析法研究脂质体融合 81
4.1.1 铽／二吡啶羧酸分析法研究水性内容物的混合 81
4.1.2 水性内容物混合的氨基萘三磺酸／对-二甲苯二溴化吡啶（ANTS/DPX）分析 87
4.1.3 NBD／罗丹明共振能量转移法分析脂质混合 88
4.1.4 荧光分析测定内侧单分子层的混合 90
4.2 荧光分析法研究脂质体的渗透性 92
4.2.1 羧基荧光素或钙黄绿素的释放 92
4.2.2 Tb/DPA复合物的释放 92
4.2.3 ANTS/DPX的释放 92
4.3 荧光法检测蛋白质与磷脂膜的结合 93
4.3.1 通过膜结合的荧光团检测 93
4.3.2 用膜内蛋白缔合的荧光团检测 95
4.4 脂质体作为pH传感器研究细胞相互作用 97
4.4.1 Pyranine（HPTS）分析法 98
4.4.2 双荧光团分析 102
4.5 双光子激发荧光显微法检测巨大型脂质体中的脂质相 104
4.5.1 直接观察双分子层中脂质区域共存 104
4.5.2 巨大型单层脂质体 104
4.5.3 双光子激发显微法 106
4.5.4 二元磷脂混合物中凝胶相／液相共存的观察 108
致谢 110
参考文献 111
第5章 脂质体的稳定性、贮存及灭菌 115
5.1 引言 115
5.2 防止化学降解 115
5.2.1 磷脂氧化 115
5.2.2 磷脂的水解 117
5.3 防止物理变化 119
5.4 脂质体的冻干 120
5.4.1 引言 120
5.4.2 脂质体冻干的重要因素 120
5.4.3 冻干状态的稳定性 124
5.4.4 冻干方案示例 125
5.5 无菌脂质体制剂的制备 126
参考文献 127
第6章 用大单室囊泡包封弱碱性药物、反义寡核苷酸和质粒DNA递送药物 129
6.1 引言 129
6.2 磷脂浓度的测定 130
6.3 用确定孔径的聚碳酸酯膜挤出制备大单室脂质体 132
6.4 弱碱性药物基于跨膜pH梯度在LUV中积聚 133
6.5 包封基因药物的脂质体系统：用于体内递送基因和反义寡核苷酸的长循环载体 140
参考文献 145
第7章 脂质体的表面修饰 149
7.1 引言 149
7.2 蛋白质和多肽连接到脂质体表面 149
7.2.1 蛋白质和多肽通过氨基与脂质体结合 150
7.2.2 通过巯基将蛋白质连接到脂质体上 157
7.3 将碳水化合物（糖）或其他小分子结合于脂质体表面 166
7.4 将诊断用金属原子连接于脂质体表面 168
7.4.1 低分子质量螯合物DTPA与脂质相连，从而插入脂质体膜 169
7.4.2 在与脂质体结合的螯合物上负载金属 172
参考文献 175
第8章 空间保护型长循环脂质体 178
8.1 引言 178
8.2 空间保护聚合物（PEG）与脂质体相连接 179
8.2.1 脂质体中插入PEG 179
8.2.2 在预制的脂质体上连接PEG 181
8.2.3 长循环脂质体的体内分布对其粒径的依赖性 182
8.2.4 长循环脂质体在肿瘤组织中的蓄积 182
8.3 不同配体与脂质体中接枝聚合物的远端相连 184
8.3.1 配体与肼化PEG相连 188
8.3.2 配体与PDP活化的PEG相连 190
8.3.3 通过COOH-活化的PEG连接配体 193
8.3.4 将含有伯氨基的配体与含有pNP-PEG-PE的脂质体相连 194
8.3.5 制备“配体-PEG-脂质”结合物并将其插入脂质体中 196
8.4 脂质体表面上可解离的PEG 203
8.5 对PEG化脂质体的消除有影响作用的生物因素 204
参考文献 205
第9章 生物系统中的脂质体 208
9.1 引言 208
9.2 脂质体与细胞的相互作用 208
9.2.1 脂质体细胞相互作用的可能方式：吸附、（受体介导的）胞吞作用、脂质交换、融合 208
9.2.2 标记物 210
9.2.3 细胞系和原代细胞培养 210
9.2.4 肝细胞的分离及培养 212
9.3 脂质体的生物分布 217
9.3.1 动物模型／种属差异 217
9.3.2 体内脂质体-细胞相互作用 218
9.3.3 标记物 219
9.3.4 脂质体的动力学及组织分布 219
致谢 222
参考文献 222
第10章 基因递送中的阳离子脂质体 225
10.1 引言 225
10.2 质粒DNA的分离 230
10.3 质粒DNA浓度的定量 231
10.4 N/P比的计算 234
参考文献 234
Ⅱ 专题和应用 235
第11章 pH敏感脂质体 237
11.1 引言 237
11.2 pH敏感的机理 238
11.3 方法 242
11.3.1 pH敏感脂质体的制备 242
11.3.2 pH敏感脂质体的表征 244
11.3.3 pH敏感脂质体的细胞结合 245
参考文献 246
第12章 放射标记脂质体用于造影和生物学分布研究 249
12.1 引言 249
12.2 用于追踪放射标记脂质体的仪器 249
12.2.1 γ射线照相机 249
12.2.2 正电子发射断层成像照相机 250
12.2.3 γ井型计数器 251
12.3 γ-发射放射性核素标记脂质体的方法 252
12.3.1 概述 252
12.3.2 用于标记脂质体的放射性核素 252
12.3.3 放射性核素标记脂质体的方法 253
12.4 放射标记脂质体的表征 256
12.4.1 放射标记体外稳定性评价 256
12.4.2 体内放射标记评价 257
12.5 图像采集和分析方法 257
12.6 以γ井型计数器测定组织生物学分布 260
参考文献 261
第13章 恒温滴定量热法（ITC） 263
13.1 引言 263
13.2 仪器和技术原理 264
13.3 MCS ITC的计算机辅助测量 265
13.3.1 热力滴定 265
13.4 临界胶束浓度的评价 268
13.4.1 热动力学背景 268
13.4.2 测量 269
13.5 表面活性剂-双分子层膜平衡 270
13.5.1 表面活性剂分配进入脂质膜 270
13.5.2 脂质体增溶 273
参考文献 275
第14章 囊泡型磷脂凝胶（VPG） 276
14.1 背景 276
14.1.1 静注用脂质体面临的生物药剂学和技术上的挑战 276
14.1.2 局部给药脂质体面临的生物药剂学和技术上的挑战 276
14.1.3 磷脂分散体：溶胀和相 277
14.1.4 机械应力：囊泡分散体和囊泡型磷脂凝胶的形成 277
14.1.5 VPG的概念 277
14.2 VPG的制备 278
14.2.1 用单一磷脂制备VPG 278
14.2.2 用两种或多种脂质制备VPG 279
14.3 VPG载药 280
14.3.1 直接包封 280
14.3.2 被动载药 280
14.3.3 掺入／结合 281
14.4 VPG的灭菌 281
14.5 VPG的表征 282
14.5.1 形态 282
14.5.2 流变学、黏性 282
14.5.3 体外的缓释行为 282
14.6 由VPG制备SUV分散体 284
14.7 由VPG制备的SUV分散体的表征 285
14.7.1 囊泡粒径分布 285
14.7.2 包封率 285
14.8 体内应用 286
14.8.1 吉西他滨VPG的制备和体外表征 286
14.8.2 肿瘤内注射吉西他滨VPG 287
14.8.3 静注吉西他滨VPG 287
参考文献 289
第15章 脂质体DNA疫苗：包封操作 291
15.1 引言 291
15.2 材料 292
15.3 采用脱水-再水化法将质粒DNA包封于脂质体中 292
15.3.1 溶液的配制 292
15.3.2 操作步骤 292
参考文献 297
附录 298
索引 306