第1章 引言 1
1.1 可变剪接调控的介绍 1
1.1.1 前体RNA可变剪接 1
1.1.2 剪接位点的识别和选择 5
1.1.3 帮助剪接位点识别 6
1.1.4 抑制剪接位点识别 8
1.1.5 位置依赖性的剪接调控 11
1.1.6 RNA结构在可变剪接调控中的作用 12
1.1.7 蛋白因子调控可变剪接 13
1.1.8 转录偶联的可变剪接调控 15
1.1.9 可变剪接和组织特异性 16
1.1.10 组成型剪接调控因子调控可变剪接 19
1.1.11 可变剪接与人类疾病 20
1.1.12 展望 20
1.2 SMA和SMN的介绍 22
1.2.1 SMA疾病的介绍 22
1.2.2 SMA疾病相关的SMN2外显子7可变剪接的机制 27
1.2.3 SMA的治疗方面的进展 30
1.3 hnRNP U的介绍 32
1.4 本课题的研究内容及意义 33
1.4.1 课题研究的内容 33
1.4.2 课题的研究意义 33
第2章 材料和方法 35
2.1 材料 35
2.1.1 菌株、质粒及细胞系 35
2.1.2 生化药品及来源 35
2.1.3 细胞培养及操作相关的试剂 36
2.1.4 酶类和DNA marker，蛋白marker 36
2.1.5 抗体及其相关 37
2.1.6 ssRNA和siRNA合成 37
2.1.7 本研究所用引物 38
2.1.8 分析软件和网络资源 41
2.1.9 图像编辑软件 42
2.1.10 仪器 42
2.2 溶液的配制 43
2.2.1 细菌用抗生素的配制 43
2.2.2 蛋白纯化中所用的缓冲液 43
2.2.3 DMEM细胞培养基的配制 44
2.2.4 细胞专用PBS的制备 44
2.2.5 细胞专用胰酶的配制 44
2.2.6 免疫沉淀及免疫印迹相关溶液的配方 44
2.3 方法 45
2.3.1 E.coli RNaseⅢ的制备和纯化 45
2.3.2 人类RNA结合蛋白esiRNA库的制备 47
2.3.3 细胞培养和转染 54
2.3.4 免疫印迹 56
2.3.5 RT-PCR 56
2.3.6 Trizol中提取蛋白 58
2.3.7 突变克隆 58
2.3.8 克隆的构建 59
2.3.9 免疫共沉淀 59
2.3.10 RIP-PCR 60
2.3.11 免疫共定位 60
2.3.12 CLIP-seq实验流程及注意事项 61
2.3.13 RNA-seq 72
第3章 结果与讨论 74
3.1 RN Ai筛选发现HnRNP U是一个新的抑制SMN2可变外显子7剪接的剪接调控因子 74
3.2 hnRNP U沉默同样会增强SMN1的剪接，暗示hnRNP U不是通过靶向外显子7的C到T变化所产生的ESS而起作用的 77
3.3 hnRNP U抑制SMN2的剪接不依赖于任何已知的ISS 79
3.4 hnRNP U可能不是通过影响转录延伸来抑制SMN外显子7的剪接的 80
3.5 hnRNP U在体外不与SMN2外显子7及附近的内含子RNA结合，而在细胞内结合SMN2转录本 82
3.6 大规模筛选人类RNA结合蛋白发现了另外8个新的抑制SMN2外显子7剪接的蛋白质，其中5个是与U2 snRNP相互作用的蛋白 83
3.7 hnRNP U与U2AF65/35通过RNA依赖的方式相互结合，并协同调控SMN2外显子7的剪接 86
3.8 CLIP鉴定hnRNP U结合的RNA靶标 87
3.9 hnRNP U结合U2 snRNA，证明它是U2 snRNP的一个重要组分 89
第4章 研究工作总结和展望 92
4.1 工作总结 92
4.2 展望 93
参考文献 96
缩写索引 113
致谢 115