第1章 大肠杆菌、质粒和噬菌体 1
1.1 培养基的制备及细菌学工具 2
1.1.1 极限培养基 2
1.1.2 丰富培养基 2
1.1.3 固体培养基 3
1.1.4 实验工具 5
1.2 在液体培养基中培养 5
1.2.1 基本方案1过夜培养 5
1.2.2 基本方案2大体积培养 6
1.2.3 基本方案3利用计数板监测生长情况 6
1.2.4 基本方案4利用分光光度计监测生长情况 6
1.3 固体培养基上培养 7
1.3.1 基本方案1通过连续稀释法滴定和分离细菌菌落 7
1.3.2 基本方案2通过平板划线法分离单菌落 7
1.3.3 基本方案3通过铺平板分离单个菌落 7
1.3.4 基本方案4影印平板 7
1.3.5 辅助方案菌株的保存和复苏 8
1.4 经典细菌遗传学选论 8
1.5 质粒载体 13
质粒载体的选择 13
1.6 质粒DNA的小量制备 20
1.6.1 基本方案1碱裂解小量制备 20
1.6.2 备选方案96孔微量滴定板碱裂解法 21
1.6.3 基本方案2煮沸小量制备法 22
1.7 质粒DNA的大量制备 22
1.7.1 基本方案1碱裂解法制备粗制裂解物 22
1.7.2 基本方案2氯化铯／溴化乙锭平衡离心法 24
1.7.3 备择方案利用阴离子交换层析或分子筛层析纯化质粒DNA 25
1.8 将质粒DNA导入细菌细胞 26
1.8.1 基本方案1 CaCl2转化法 26
1.8.2 备择方案一步法制备和转化感受态细菌 27
1.8.3 基本方案2高效率的电转化方法 27
1.9 λ噬菌体概述 29
1.9.1 裂解性生长 29
1.9.2 溶源性生长 30
1.10 作为克隆载体的λ噬菌体 32
1.10.1 用λ噬菌体的优点 32
1.10.2 选择插入的DNA 32
1.10.3 λ噬菌体来源的克隆载体的图谱 35
1.11 λ噬菌体铺平板产生噬斑 35
1.11.1 基本方案1通过连续稀释法分离单个噬斑 35
1.11.2 基本方案2噬菌体转染和体外包装构建 36
1.12 培养λ衍生的噬菌体载体 37
1.12.1 基本方案通过平板裂解制备噬菌体库 37
1.12.2 备择方案制备液体裂解物 38
1.13 从噬菌体裂解液中制备λDNA 38
基本方案通过分级平衡梯度离心制备DNA 38
1.14 源于丝状噬菌体的载体 40
1.15 利用M13噬菌体衍生载体制备单链DNA 43
基本方案利用辅助噬菌体从质粒制备单链DNA 43
第2章 DNA的制备和分析 45
电泳及其应用 45
凝胶和电路 46
2.1 水溶液中DNA的纯化和浓缩 46
2.1.1 基本方案DNA的酚抽提和乙醇沉淀 47
2.1.2 备择方案1异丙醇沉淀DNA 47
2.1.3 辅助方案1丁醇浓缩DNA 48
2.1.4 辅助方案2醚抽提法去除残存酚、氯仿或丁醇 48
2.1.5 备择方案2硅膜离心柱法纯化DNA 49
2.1.6 备择方案3 RNA及DNA稀溶液的纯化和浓缩 49
2.1.7 备择方案4乙醇沉淀法去除低分子质量的寡核苷酸和核苷三磷酸 50
2.2 阴离子交换色谱法纯化DNA 50
基本方案 50
2.3 从哺乳动物组织中制备基因组DNA 52
基本方案 52
2.4 从植物组织中制备基因组DNA 53
2.4.1 基本方案氯化铯离心法制备植物DNA 53
2.4.2 备择方案CTAB制备植物DNA 54
2.5 从细菌中制备基因组DNA 55
2.5.1 基本方案细菌基因组DNA的小量制备 55
2.5.2 备择方案氯化铯法大规模制备细菌基因组DNA 56
2.5.3 辅助方案从所得到的DNA制备物中除去多糖 57
2.6 琼脂糖凝胶电泳 57
2.6.1 基本方案DNA片段在标准琼脂糖凝胶上的分离 57
2.6.2 辅助方案微型凝胶及中型凝胶 58
2.7 脉冲场凝胶电泳 59
2.7.1 基本方案倒转电场凝胶电泳 59
2.7.2 备择方案钳位均匀电场电泳（CHEF电泳） 60
2.7.3 辅助方案高分子质量DNA样品和分子质量标准物的制备 61
2.8 从琼脂糖凝胶中分离和纯化大的DNA限制酶切片段 62
2.8.1 基本方案1琼脂糖凝胶电洗脱 62
2.8.2 基本方案2 NA-45纸电泳 63
2.8.3 基本方案3低熔点琼脂糖凝胶分离DNA 64
2.8.4 备择方案1 β-琼脂糖酶消化法从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA 65
2.8.5 备择方案2硅膜离心柱从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA 65
2.8.6 辅助方案溴化乙锭斑点定量法对DNA浓度进行快速估测 66
2.9 常规凝胶电泳分离小分子DNA片段 67
2.9.1 基本方案1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 67
2.9.2 备择方案聚丙烯酰胺凝胶DNA小片段的电洗脱 68
2.9.3 基本方案2筛分型琼脂糖凝胶电泳 69
2.10 DNA的毛细管电泳 69
2.10.1 基本方案1寡核苷酸的分离 72
2.10.2 基本方案2定量PCR分析 73
2.10.3 备择方案基因型分析 75
2.11 Southern印迹法 75
2.11.1 基本方案用高盐缓冲液在尼龙膜或硝酸纤维素膜上进行Southern印迹 75
2.11.2 辅助方案紫外透射仪的校准 78
2.11.3 备择方案1用碱性缓冲液在尼龙膜上进行Southern印迹 78
2.11.4 备择方案2用向下毛细管转移法进行Southern印迹 79
2.11.5 备择方案3从聚丙烯酰胺凝胶至尼龙膜的电转印法 79
2.12 DNA的斑点和狭线印迹 80
2.12.1 基本方案用多样抽滤加样器在不带电荷的尼龙膜和硝酸纤维素膜上进行DNA斑点和狭线印迹 80
2.12.2 备择方案1用多样抽滤加样器在带正电荷的尼龙膜上进行DN A斑点和狭线印迹 82
2.12.3 备择方案2 DNA斑点印迹的手工制备 82
2.13 DNA印迹的杂交分析 83
2.13.1 基本方案放射性标记的DNA探针对DNA印迹的杂交分析 84
2.13.2 备择方案用放射性标记的RNA探针对DNA印迹进行杂交分析 85
2.13.3 辅助方案从杂交膜上除去探针 87
2.14 寡核苷酸的合成及纯化 89
2.14.1 关于核酸的化学合成法的介绍 89
2.14.2 核酸合成方案 92
2.14.3 寡核苷酸纯化方案 93
2.15 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡核苷酸 94
基本方案 94
第3章 DNA和RNA的酶学操作 97
3.1 限制性内切核酸酶消化DNA 97
3.1.1 基本方案单酶切消化单个DNA样品 98
3.1.2 备择方案1多限制性内切核酸酶消化DNA 99
3.1.3 备择方案2消化多个DNA样品 101
3.1.4 备择方案3限制性内切核酸酶对DNA部分消化 102
3.1.5 辅助方案DNA的甲基化 102
3.2 核酸操作的常用试剂和放射性同位素 103
3.2.1 储液溶液 103
3.2.2 10×酶缓冲液 106
3.2.3 核苷三磷酸 110
3.2.4 标记核酸的放射性同位素 111
3.2.5 基本方案酸沉淀法测定DNA和RNA中的放射性 112
3.2.6 备择方案柱离心法从未掺入的前体dNTP分离放射性标记DNA 113
3.3 DNA依赖的DNA聚合酶 114
3.3.1 基本方案1缺口翻译标记DNA 114
3.3.2 基本方案2 DNA的3′端标记 115
3.3.3 基本方案3修复凸出的3′或5′端以产生平端 116
3.3.4 基本方案4随机寡核苷酸引物介导的DNA标记 116
3.3.5 天然T7噬菌体DNA聚合酶 118
3.3.6 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶 118
3.3.7 TaqDNA聚合酶 119
3.4 不依赖于模板的DNA聚合酶 119
末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶） 119
3.5 依赖RNA的DNA聚合酶 120
逆转录酶 120
3.6 依赖DNA的RNA聚合酶 121
噬菌体的RNA聚合酶：SP6、T7和T3 121
3.7 磷酸酶和激酶 121
3.7.1 细菌碱性磷酸酶（BAP）和小牛肠碱性磷酸酶（CIP） 121
3.7.2 T4噬菌体多核苷酸激酶 122
3.8 外切核酸酶 122
3.8.1 外切核酸酶V（exoⅦ） 122
3.8.2 λ噬菌体外切核酸酶（λxo） 123
3.8.3 T7噬菌体基因6外切核酸酶 123
3.8.4 外切核酸酶Ⅲ（exo Ⅲ） 123
3.9 内切核酸酶 124
3.9.1 Bal 31核酸酶 124
3.9.2 S1核酸酶 124
3.9.3 绿豆核酸酶 125
3.9.4 微球菌核酸酶 125
3.9.5 脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNA酶Ⅰ） 126
3.9.6 无RNA酶活性的DNA酶Ⅰ 126
3.10 核糖核酸酶 127
3.10.1 核糖核酸酶A（RNA酶A） 127
3.10.2 无DNA酶的RNA酶A 127
3.10.3 核糖核酸酶H（RNA酶H） 127
3.10.4 核糖核酸酶T1 128
3.11 DNA连接酶 128
3.11.1 T4噬菌体DNA连接酶 128
3.11.2 大肠杆菌DNA连接酶 129
3.12 RNA连接酶 129
T4 RNA连接酶 129
3.13 DNA片段的亚克隆 130
3.13.1 基本方案DNA片段的亚克隆 130
3.13.2 备择方案凝胶块中DNA片段的连接 131
3.14 聚合酶链反应构建重组DNA 132
基本方案DNA片段亚克隆 132
3.15 非同位素探针的标记和比色检测 136
3.15.1 基本方案1用切口平移法制备生物素酰化的探针 136
3.15.2 基本方案2用随机寡核苷酸引物合成法制备生物素酰化探针 137
3.15.3 辅助方案生物素酰化探针的比色法检测 138
3.15.4 备择方案制备和检测地高辛标记的DNA探针 139
3.16 非同位素探针的化学发光检测 139
3.16.1 基本方案生物素标记探针的化学发光检测 140
3.16.2 备择方案地高辛标记探针的化学发光检测 142
3.16.3 辅助方案紫外光源的标准化 142
第4章 RNA的制备和分析 144
4.1 异硫氰酸胍法制备总RNA 145
4.1.1 基本方案从组织或培养细胞中一步法分离RNA 145
4.1.2 备择方案1 CsCl法纯化从培养细胞中提取的RNA 146
4.1.3 备择方案2 CsCl纯化组织RNA 147
4.2 酚／SDS法制备植物RNA 148
基本方案 148
4.3 制备细菌RNA 149
4.3.1 基本方案1从革兰氏阴性菌中分离高质量的RNA 149
4.3.2 备择方案从革兰氏阴性菌中快速分离RNA 150
4.3.3 基本方案2从革兰氏阳性菌分离RNA 151
4.4 poly（A）＋RNA的制备 152
基本方案 152
4.5 用单链DNA探针进行mRNA的S1核酸酶作图分析 153
4.5.1 基本方案用M13模板进行mRNA的S1作图 154
4.5.2 备择方案1从双链质粒模板合成单链探针 156
4.5.3 备择方案2用寡核苷酸探针进行mRNA的定量S1分析 156
4.5.4 辅助方案S1核酸酶mRNA定量分析的控制（参数） 157
4.6 核酸酶保护试验 157
4.6.1 基本方案 157
4.6.2 辅助方案1模板DNA的制备 159
4.6.3 辅助方案2 RNA探针的胶提纯 159
4.7 引物延伸 160
基本方案 160
4.8 RNA的Northern印迹和狭线杂交分析 162
4.8.1 基本方案甲醛琼脂糖凝胶电泳分离RNA的Northern杂交 162
4.8.2 备择方案1经乙二醛／二甲基亚砜处理的变性RNA Northern杂交 164
4.8.3 备择方案2经狭线印迹固定的未分级RNA样品的Northern杂交 165
4.8.4 辅助方案Northern印迹探针的除去 166
4.9 鉴定新转录的RNA 166
4.9.1 基本方案在哺乳动物细胞中的核失控转录 167
4.9.2 备择方案1用杜恩斯匀浆器分离细胞核 169
4.9.3 备择方案2蔗糖梯度离心分离细胞核 169
4.9.4 辅助方案制备用于核失控转录实验的硝酸纤维素膜 170
第5章 重组DNA文库的构建 172
5.1 基因组DNA文库概述 174
5.1.1 代表性与随机性 174
5.1.2 亚基因组文库 174
5.1.3 基因组DNA文库载体 175
5.2 cDNA文库概述 175
5.3 噬菌体文库的扩增 176
基本方案 176
5.4 黏粒和质粒文库的扩增 177
基本方案 177
第6章 重组DNA文库的筛选 179
6.1 噬菌体文库的铺平板和转移 181
基本方案噬菌体文库的铺平板和转移 181
6.2 黏粒及质粒文库的铺平板和转移 182
基本方案黏粒及质粒文库的铺平板和转移 182
6.3 应用DNA片段作探针 183
6.3.1 基本方案在甲酰胺溶液中杂交 184
6.3.2 备择方案在水溶液中杂交 184
6.4 使用合成寡核苷酸作探针 185
6.4.1 基本方案在氯化钠／柠檬酸钠溶液（SSC）中杂交 185
6.4.2 备择方案在氯化四甲铵（TMAC）中杂交 186
6.4.3 辅助方案混合寡核苷酸5′端标记 188
6.5 噬菌体克隆的纯化 189
基本方案 189
6.6 黏粒和质粒克隆的纯化 190
基本方案 190
6.7 在λ噬菌体噬斑中产生的融合蛋白的免疫筛选 190
6.7.1 基本方案用抗体筛选λgt11表达文库 190
6.7.2 备择方案在抗体筛选之前用IPTG诱导融合蛋白表达 191
6.8 在杂交选择和翻译后进行的免疫筛选 192
基本方案 192
6.9 用单克隆抗体表达克隆 194
6.9.1 基本方案分离编码细胞表面抗原的cDNA克隆 194
6.9.2 辅助方案1抗体包被平板的制备 197
6.9.3 备择方案分离编码细胞内抗原的cDNA克隆 197
6.9.4 辅助方案2制备聚偏二乙烯膜包裹的平板 199
6.10 基于重组方法（RBA）以筛选λ噬菌体文库 199
基本方案 199
第7章 DNA序列测定 204
双脱氧（Sanger）测序法 205
化学（Maxam-Gilbert）测序法 207
双脱氧法或化学测序法的选择 208
放射性标记测序反应的替代 208
其他测序技术的进展 209
计算机分析 210
7.1 DNA测序策略 210
7.1.1 双脱氧测序 211
7.1.2 化学测序 214
7.2 构建用于DNA测序的嵌套式缺失体 215
7.2.1 基本方案1用外切酶Ⅲ构建单向缺失突变体 215
7.2.2 备选方案 用［α-35S］dNTP使DNA免于外切酶Ⅲ消化 218
7.2.3 基本方案2用Bal 31核酸酶构建嵌套式缺失突变体 219
7.3 制备DNA测序模板 223
7.3.1 基本方案1制备单链M13噬菌体DNA 223
7.3.2 基本方案2从小量裂解物中制备λ噬菌体DNA 224
7.3.3 基本方案3小量制备用于化学测序的重组pSP64CS或pSP65CS质粒DNA 225
7.3.4 基本方案4小量制备用于双脱氧测序的双链质粒DNA 226
7.3.5 基本方案5用于双脱氧测序的双链质粒或λ噬菌体DNA的碱变性 227
7.3.6 基本方案6制备用于热循环测序质粒或噬菌体DNA 227
7.4 双脱氧法DNA测序 228
7.4.1 基本方案1用测序酶（经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶）进行标记／终止测序反应 230
7.4.2 备择方案1使用测序酶和Mn2＋的标记／终止测序反应 232
7.4.3 备择方案2使用TaqDNA聚合酶进行Sanger测序反应 232
7.4.4 备择方案3用5′端标记引物进行一步法测序反应 233
7.4.5 基本方案2用α-标记核苷酸进行热循环测序反应 234
7.4.6 备择方案4用5′端标记引物进行热循环测序反应 236
7.4.7 备择方案5使用荧光染料标记的引物和终止物进行循环测序 236
7.5 化学发光双脱氧DNA测序法 238
7.5.1 基本方案利用生物素标记引物的化学发光DNA测序法 239
7.5.2 备择方案1链霉亲和素和生物素酰化碱性磷酸酶两步检测法（间接法） 242
7.5.3 备择方案2用半抗原标记引物进行测序并用抗体碱性磷酸酶偶联物检测 242
7.6 化学测序法 243
7.6.1 基本方案用32P标记的DNA进行化学测序 244
7.6.2 辅助方案Tth111Ⅰ消化和末端标记 246
7.7 用于测序的变性凝胶电泳 247
7.7.1 基本方案测序胶的灌制、电泳及处理 248
7.7.2 备择方案1缓冲液梯度测序胶 251
7.7.3 备择方案2电解质梯度测序胶 251
7.7.4 备择方案3含甲酰胺的测序胶 252
第8章 克隆化DNA的诱变 253
8.1 用简并寡核苷酸在小段DNA序列中产生大量突变 254
基本方案 254
8.2 基因合成：用互为引物的长段寡核苷酸组合目的序列 257
基本方案 257
8.3 PCR介导的随机突变 258
8.3.1 基本方案DNA序列的突变 259
8.3.2 备择方案一个序列文库的突变 261
8.4 DNA的接头分区诱变 262
基本方案 262
8.5 PCR介导的诱变 264
8.5.1 基本方案1通过PCR引入限制酶切位点 264
8.5.2 基本方案2利用PCR引入点突变 267
8.5.3 备择方案通过连续PCR引入点突变 270
第9章 DNA导入哺乳动物细胞 271
转染方法的选择 271
优化转染条件 272
病毒载体 273
哺乳动物细胞培养 274
9.1 磷酸钙转染法 276
9.1.1 基本方案磷酸钙-DNA在HEPES中形成沉淀的转染方法 276
9.1.2 辅助方案哺乳动物细胞的甘油／二甲基亚砜休克 277
9.1.3 备择方案在BES中形成的磷酸钙-DNA沉淀高效转染 277
9.2 DEAE-葡聚糖转染 278
9.2.1 基本方案DEAE-葡聚糖转染法的基本操作程序 278
9.2.2 备择方案样本实验：检测酶的结构／活性关系 280
9.3 电穿孔转染法 281
9.3.1 基本方案电穿孔法转染哺乳动物细胞 281
9.3.2 备择方案植物原生质体细胞的电穿孔转染 281
9.4 阳离子脂质体介导的真核细胞转染 282
9.4.1 基本方案1阳离子脂质体介导DNA的哺乳动物贴壁细胞转染 283
9.4.2 备择方案 阳离子增强脂质体介导DNA的哺乳动物贴壁细胞转染 284
9.4.3 基本方案2阳离子脂质体介导DNA的悬浮细胞转染 285
9.4.4 基本方案3阳离子脂质体介导RNA的贴壁细胞转染 285
9.4.5 基本方案4 阳离子脂质体介导杆状病毒DNA的Sf9和Sf21昆虫贴壁细胞转染 286
9.4.6 辅助方案阳离子脂质体转染优化条件的微调 286
9.5 转染哺乳动物细胞的选择 288
9.5.1 策略安排 288
9.5.2 基本方案1哺乳动物细胞的稳定转染 290
9.5.3 基本方案2哺乳动物细胞的选择标记 291
9.6 遗传报道基因系统概述 295
9.6.1 报道载体的设计 299
9.6.2 体外报道分子分析方法 299
9.7 报道基因活性的同位素分析方法 304
9.7.1 基本方案1 CTA活性的色谱分析法 304
9.7.2 备择方案1原位裂解细胞的CAT分析方法 306
9.7.3 备择方案2 CAT活性的相抽提分析法 306
9.7.4 基本方案2人生长激素的放射免疫分析法 307
9.8 非同位素分析报道基因活性 309
9.8.1 基本方案1萤火虫萤光素酶报道基因分析 309
9.8.2 备择方案冻融裂解的细胞的萤光素酶分析 310
9.8.3 基本方案2 β-半乳糖苷酶报道基因的化学发光分析 311
9.9 用维多利亚水母绿色荧光蛋白（GFP）研究体内蛋白动力学 312
9.9.1 GFP的应用 312
9.9.2 GFP的问题 313
9.9.3 GFP突变体 314
9.9.4 显微镜设置 314
9.10 逆转录病毒转导系统概述 315
9.10.1 逆转录病毒生活周期 316
9.10.2 有复制能力的载体 317
9.10.3 无复制能力的载体 318
9.10.4 包装细胞系和病毒的产生 320
9.10.5 鼠逆转录病毒 323
9.10.6 禽逆转录病毒 324
9.10.7 安全性问题 324
9.11 建立特异的逆转录病毒产毒细胞系 325
9.11.1 基本方案将逆转录病毒载体导入包装细胞系 325
9.11.2 基本方案2测定病毒滴度：高滴度产病毒细胞克隆的鉴定分离 327
9.11.3 备择方案产毒克隆的快速评价 328
9.11.4 辅助方案培养细胞的X-gal染色 328
9.12 制备高滴度逆转录病毒上清的瞬时转染方法 329
9.12.1 基本方案1将逆转录病毒载体瞬时转染入293细胞系 329
9.12.2 辅助方案293细胞的生长和保存 330
9.12.3 基本方案2用逆转录病毒上清感染贴壁细胞 332
9.12.4 备择方案1旋转感染法感染贴壁细胞 332
9.12.5 基本方案3用逆转录病毒上清感染非贴壁细胞 333
9.12.6 备择方案2共培养感染非贴壁细胞 333
9.12.7 备择方案3旋转感染法感染非贴壁细胞 334
9.13 大规模制备和浓缩逆转录病毒原液 335
9.13.1 基本方案用离心法制备和浓缩病毒原液 335
9.13.2 备择方案1用聚乙二醇沉淀及层析法浓缩病毒 336
9.13.3 备择方案2用分子质量截留滤膜进行浓缩 336
9.14 逆转录病毒原液中辅助病毒的检测 337
9.14.1 基本方案通过药物抗性的水平传播鉴定辅助病毒 337
9.14.2 备择方案1用原病毒检测具复制能力的逆转录病毒 338
9.14.3 备择方案2用逆转录酶分析法检测辅助病毒 338
9.15 用逆转录病毒在体外及体内感染细胞 339
体外细胞感染 339
第10章 蛋白质分析 343
蛋白质分类 343
蛋白质纯化流程图 344
10.1 分光光度分析法和比色法测定蛋白质浓度 350
10.1.1 基本方案1 应用A280来测定蛋白质浓度 350
10.1.2 基本方案2应用Bradford法测定蛋白质浓度 350
10.2 定量氨基酸的分析 351
10.2.1 样品准备 351
10.2.2 计算平均组成 352
10.3 蛋白质的单向SDS凝胶电泳 353
10.3.1 电与电泳 353
10.3.2 安全性考虑 353
10.3.3 欧姆定律和电泳 354
10.3.4 基本方案1变性（SDS）不连续凝胶电泳：Laemmli凝胶法 355
10.3.5 备择方案1 Tris-tricine缓冲液系统的PAGE电泳 358
10.3.6 备择方案2 在无尿素条件下用Tris缓冲液分离多肽 360
10.3.7 备择方案3连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 361
10.3.8 备择方案4超薄凝胶的PAGE 362
10.3.9 辅助方案1一次灌制多块单一浓度凝胶 363
10.3.10 备择方案5在梯度凝胶中分离蛋白质 365
10.3.11 辅助方案2一次灌制多块梯度胶 367
10.3.12 基本方案2在单一浓度的微型凝胶上电泳 368
10.3.13 辅助方案3制备多块梯度胶 370
10.4 使用O'Farrell系统的双向凝胶电泳 371
10.4.1 基本方案1第一向凝胶（等电聚焦） 371
10.4.2 备择方案1极端碱性、酸性蛋白质的等电聚焦 373
10.4.3 基本方案2第二向凝胶 374
10.4.4 备择方案2 小型凝胶双向电泳 376
10.4.5 辅助方案组织来源的蛋白质样品的溶解和制备 377
10.5 凝胶中蛋白质的染色 377
10.5.1 基本方案1考马斯亮蓝染色 377
10.5.2 备择方案1考马斯亮蓝快染 378
10.5.3 基本方案2银染法 378
10.5.4 备择方案2非氨盐银染法 379
10.5.5 基本方案3快速银染法 380
10.5.6 辅助方案1考马斯亮蓝和银染染色的凝胶拍照 381
10.5.7 基本方案3荧光染色 382
10.5.8 备择方案4非变性胶的荧光染色 382
10.5.9 辅助方案2荧光染色胶的拍照 383
10.6 免疫印迹和免疫检测 383
10.6.1 基本方案1用转移槽转印蛋白质 383
10.6.2 备择方案1用半干转移系统转印蛋白质 385
10.6.3 备择方案2染色凝胶的印迹 386
10.6.4 辅助方案1转印蛋白的可逆染色 387
10.6.5 基本方案2用第二抗体偶联物进行免疫检测 387
10.6.6 备择方案3用亲和素生物素偶联的第二抗体进行免疫检测 388
10.6.7 基本方案3用发色底物显迹 389
10.6.8 备择方案4用发光底物显迹 390
10.6.9 辅助方案2膜的清洗和再使用 391
10.7 凝胶过滤层析 391
10.7.1 基本方案1脱盐（组分分离） 391
10.7.2 基本方案2蛋白质的分级 397
10.7.3 基本方案3分子大小的测定 400
10.7.4 辅助方案柱校正 401
10.8 离子交换层析 404
10.8.1 设计策略 404
10.8.2 基本方案1批式吸附和增加盐浓度的阶段梯度洗脱 405
10.8.3 基本方案2线性梯度洗脱的柱层析 407
10.8.4 辅助方案进行小试确定离子交换层析的起始条件 409
10.9 免疫亲和层析 414
10.9.1 基本方案可溶性或膜结合抗原的分离 414
10.9.2 备择方案1抗原的批式纯化 416
10.9.3 备择方案2低pH洗脱抗原 416
10.10 金属螯合亲和层析 417
10.10.1 基本方案天然MCAC对可溶性组氨酸尾融合蛋白的纯化 417
10.10.2 备择方案1变性条件下用MCAC纯化带组氨酸尾的不溶性融合蛋白 420
10.10.3 备择方案2 MCAC纯化蛋白质的固相复性 421
10.10.4 辅助方案NTA介质的再生 421
10.11 多肽和蛋白质的HPLC：准备工作和系统组装 422
10.11.1 多肽和蛋白质的属性及其在HPLC方法发展的应用 422
10.11.2 HPLC中多肽和蛋白质的检测 422
10.11.3 起始程序 423
10.11.4 样品的准备 425
10.11.5 准备流动相 425
10.11.6 组装HPLC装置 426
10.11.7 用洗脱液活化泵和低压线 426
10.11.8 HPLC系统的准备 426
10.11.9 HPLC系统的梯度延滞（滞留体积） 427
10.11.10 和柱连接 428
10.11.11 给HPLC装置设计程序 428
10.11.12 注射样品 428
10.11.13 检测功能性HPLC系统 428
10.11.14 日志 428
10.12 多肽和蛋白质的HPLC：标准操作条件 429
10.12.1 HP-SEC的标准操作条件 430
10.12.2 HP-NPC的标准操作条件 431
10.12.3 HP-HIC的标准操作条件 432
10.12.4 HP-IEX的标准操作条件 433
10.12.5 HP-HILIC的标准操作条件 434
10.12.6 HP-IMAC的标准操作条件 435
10.12.7 HP-BAC的标准操作条件 436
10.12.8 RP-HPLC的标准操作条件 437
10.12.9 用RP-HPLC技术对多肽和蛋白质混合物脱盐 440
10.13 肽的反相分离 441
10.13.1 基本方案1 5-500PMOL水平肽的反相分离 441
10.13.2 基本方案2不超过5 pmol肽的反相分离 442
10.13.3 辅助方案毛细管HPLC系统的装配 443
10.14 通过表位标签纯化重组蛋白研究蛋白质互相作用 444
基本方案带表位标签重组蛋白的免疫沉淀 444
10.15 免疫沉淀 446
10.15.1 基本方案1用非变性去垢剂溶液裂解的悬浮细胞的免疫沉淀 446
10.15.2 备择方案1用非变性去垢剂溶液裂解的贴壁细胞的免疫沉淀 449
10.15.3 备择方案2用变性去垢剂裂解的细胞的免疫沉淀 450
10.15.4 备择方案3不用去垢剂裂解的细胞的免疫沉淀 450
10.15.5 备择方案4用抗体-Sepharose偶联物免疫沉淀 451
10.15.6 辅助方案制备抗体-Sepharose偶联物 453
10.15.7 备择方案5用抗Ig血清免疫沉淀放射性标记抗原 454
10.15.8 基本方案2免疫沉淀重俘获 455
10.16 克隆化基因的体外转录和翻译 456
基本方案 456
10.17 氨基酸代谢标记 458
10.17.1 ［35S］标记复合物操作的安全预防 458
10.17.2 基本方案 ［35S］标记甲硫氨酸对悬浮培养细胞的脉冲标记 459
10.17.3 备择方案1贴壁细胞的［35S］甲硫氨酸脉冲标记 460
10.17.4 备择方案2 ［35S］甲硫氨酸脉冲示踪标记细胞 460
10.17.5 备择方案3 ［35S］甲硫氨酸的长期细胞标记 461
10.17.6 备择方案4用其他放射性标记的氨基酸进行代谢标记 461
10.17.7 辅助方案TCA沉淀测定标记掺入量 462
10.18 分离蛋白质用于微量序列分析 463
10.18.1 基本方案1测定通过SDS-PAGE转移到PVDF膜上样品的氨基酸序列 463
10.18.2 辅助方案准备SDS-PAGE蛋白质样品 465
10.18.3 基本方案2测定N端封闭蛋白质的内部序列 466
10.19 蛋白质和多肽的毛细管电泳 467
10.19.1 使用仪器 467
10.19.2 战略计划 469
10.19.3 基本方案1等电点聚焦分离蛋白质 469
10.19.4 基本方案2蛋白质的分离 470
10.19.5 基本方案3解析多肽的分离 471
10.19.6 基本方案4微量制备毛细管电泳：多次分离 472
10.19.7 备择方案微量制备毛细管电泳：单次分离 473
第11章 免疫学 475
11.1 酶与抗体的偶联 477
11.1.1 基本方案辣根过氧化物酶HRPO与抗体的偶联 477
11.1.2 备择方案碱性磷酸酶与抗体的偶联 478
11.2 酶联免疫吸附分析（ELISA） 478
11.2.1 基本方案间接ELISA法检测特异性抗体 479
11.2.2 备择方案1直接竞争ELISA法检测可溶性抗原 480
11.2.3 备择方案2抗体夹心ELASA法检测可溶性抗原 481
11.2.4 备择方案3双抗体夹心ELISA检测特异性抗体 482
11.2.5 备择方案4直接细胞ELISA法检测细胞表面抗原 483
11.2.6 备择方案5间接细胞ELISA法检测对表面抗原具有特异性的抗体 484
11.2.7 辅助方案1正交连续稀释法确定最佳试剂浓度 485
11.2.8 辅助方案2制备细菌裂解物抗原 486
11.3 老鼠的免疫 487
11.3.1 基本方案制备免疫脾细胞：用可溶性抗原致敏 487
11.3.2 备择方案1用复合抗原（膜、整个细胞和微生物）进行免疫 488
11.3.3 备择方案2用电泳分离的抗原进行免疫 488
11.4 单克隆抗体上清和腹水的制备 488
11.4.1 基本方案1单克隆抗体上清的制备 489
11.4.2 备择方案1单克隆抗体上清的大量制备 489
11.4.3 备择方案2大量制备杂交瘤或细胞系 490
11.4.4 基本方案2含单克隆抗体的腹水的制备 491
11.5 单克隆抗体的纯化 492
11.5.1 基本方案用蛋白A-琼脂糖进行纯化 492
11.5.2 备择方案1蛋白A-琼脂糖的备择缓冲液系统 493
11.5.3 备择方案2用抗原葡聚糖和抗鼠Ig-葡聚糖进行纯化 493
11.6 多克隆抗血清的制备 494
11.6.1 基本方案用弗氏佐剂免疫制备多克隆抗体 495
11.6.2 备择方案应用其他佐剂制备多克隆抗血清 496
11.6.3 辅助方案由全血制备血清 497
11.7 从抗血清、腹水或杂交瘤上清液中纯化免疫球蛋白G组分 497
11.7.1 基本方案用饱和硫酸铵沉淀IgG 497
11.7.2 备择方案用DEAE-Affi-Gel Blue层析法分级分离IgG 498
11.8 免疫原性肽的选择 499
11.9 抗肽抗体的制备 501
11.9.1 基本方案通过化学偶联法用MBS将合成肽偶联到载体蛋白上 501
11.9.2 备择方案用戊二醛将合成肽通过化学偶联法交联到载体蛋白上 502
第12章 DNA-蛋白质相互作用 503
12.1 从哺乳动物细胞中制备核和细胞质提取物 505
12.1.1 基本方案核提取物的制备 505
12.1.2 辅助方案1细胞核提取方法的优化 508
12.1.3 辅助方案2细胞质（S-100）组分的制备 508
12.2 DNA结合在凝胶电泳中的迁移率变动分析 509
12.2.1 基本方案迁移率变动分析 510
12.2.2 备择方案1竞争迁移率变动分析 512
12.2.3 备择方案2抗体超变动分析 512
12.2.4 备择方案3多元迁移率变动分析 513
12.3 用来分析蛋白质-DNA相互作用的甲基化和尿嘧啶干扰分析法 514
12.3.1 基本方案1甲基化干扰分析法 514
12.3.2 基本方案2尿嘧啶干扰分析法 515
12.4 DNA酶Ⅰ足迹分析法 517
12.4.1 基本方案DNA酶Ⅰ足迹滴定 518
12.4.2 辅助方案用光密度及数值分析法决定蛋白质结合的平衡常数 520
12.4.3 辅助方案粗制品的DNA酶足迹分析法 522
12.5 蛋白质与核酸的紫外交联 524
12.5.1 基本方案用溴脱氧尿苷（BrdU）取代的探针进行紫外交联 524
12.5.2 备择方案1用非溴脱氧尿苷（BrdU）取代的探针进行紫外交联 526
12.5.3 备择方案2原位紫外交联 527
12.6 用生物素／链霉亲和素亲和系统纯化DNA结合蛋白 527
12.6.1 基本方案用生物素／链霉亲和素亲和系统纯化DNA结合蛋白 527
12.6.2 备择方案1用微型柱进行纯化 529
12.6.3 备择方案2用链霉亲和素琼脂糖进行纯化 530
12.7 编码DNA结合蛋白的cDNA克隆的检测、纯化和鉴定 530
12.7.1 基本方案用位点识别DNA筛选λgt11表达文库 531
12.7.2 备择方案用盐酸胍进行干燥膜的变性／复性循环 533
12.7.3 辅助方案从重组溶源菌中制备粗提物鉴定DNA结合蛋白的活性 533
12.8 用克隆化基因在体外合成的蛋白质分析DNA-蛋白质相互作用 535
基本方案 535
12.9 序列特异性DNA结合蛋白的亲和层析纯化 536
12.9.1 基本方案1 DNA亲和介质的制备 536
12.9.2 备择方案将DNA偶联于溴化氰活化的琼脂糖上 539
12.9.3 辅助方案1用制备性凝胶电泳纯化寡核苷酸 539
12.9.4 基本方案2 DNA亲和层析法 541
12.9.5 辅助方案2非特异竞争性DNA的选择和制备 543
12.10 PCR辅助的结合位点选择确定蛋白质-DNA序列的特异性 544
12.10.1 基本方案 544
12.10.2 备择方案从迁移率变动凝胶中分离和分析结合的寡核苷酸 548
第13章 酿酒酵母 550
13.1 酵母菌培养基的制备 551
13.1.1 液体培养基 552
13.1.2 固体培养基 554
13.1.3 菌株的保存与复苏 557
13.2 酵母菌的培养与操作 558
13.2.1 基本方案1液体培养基培养 558
13.2.2 基本方案2固体培养基培养 559
13.2.3 基本方案3细胞密度检测 559
13.2.4 基本方案4影印平板检测酵母菌表型 559
13.2.5 基本方案5交配型的确定 559
13.2.6 菌株的构建和四分体孢子的分析 560
13.2.7 辅助方案解剖针的制作 565
13.2.8 备择方案随机孢子分析 565
13.3 酵母菌基因组转座子的诱变 566
13.3.1 战略计划 567
13.3.2 基本方案利用mTn诱变文库DNA得到酵母菌突变体 567
13.3.3 辅助方案1小载体聚合酶链反应 569
13.3.4 辅助方案2 mTn诱变基因产物的表位标记 571
13.4 酵母菌载体与克隆基因表达产物的检测 573
13.4.1 基本方案1构建lacZ融合载体研究酵母菌基因调控 573
13.4.2 基本方案2 β-半乳糖苷酶在液体培养基中的检测 573
13.4.3 备择方案利用滤纸提取检测法筛选表达β-半乳糖苷酶的酵母菌落 574
13.5 将DNA导入酵母细胞 575
13.5.1 基本方案乙酸锂转化 575
13.5.2 备择方案电穿孔转化 576
13.5.3 辅助方案单链高分子质量载体DNA的制备 578
13.6 利用互补作用克隆酵母菌基因 579
基本方案 579
13.7 酵母细胞中质粒的加工 581
13.7.1 基本方案1从酵母细胞中分离质粒 581
13.7.2 基本方案2穿梭质粒 581
13.7.3 基本方案3定位突变质粒缺口修复技术和等位基因修复技术 583
13.8 克隆化酵母DNA的加工 584
13.8.1 基本方案1整合性转化 584
13.8.2 基因置换技术 585
13.8.3 基本方案5一步整合置换产生修饰基因 589
13.8.4 备择方案2通过移换产生修饰基因 590
13.8.5 基本方案6通过铜诱导双重关闭技术产生条件等位基因 590
13.9 酵母DNA的制备 592
13.9.1 基本方案从酵母菌中快速分离质粒DNA 592
13.9.2 备择方案酵母染色体DNA的快速分离 593
13.10 酵母菌RNA的制备 594
13.10.1 基本方案热酸性酚抽提法制备酵母RNA 594
13.10.2 备择方案1玻璃珠制备RNA 595
13.10.3 备择方案2 poly（A）＋RNA的制备 595
13.11 制备酵母蛋白抽提物 596
13.11.1 基本方案原生质球制备及裂解 596
13.11.2 辅助方案差速离心法制备细胞核 597
13.11.3 备择方案1玻璃珠破细胞法 598
13.11.4 备择方案2液氮破细胞法 598
第14章 原位杂交和免疫组织化学 600
14.1 组织、胚胎及单细胞的固定、包埋及切片 601
14.1.1 基本方案组织和胚胎的多聚甲醛固定及石蜡包埋 601
14.1.2 备择方案悬浮及培养细胞的PFA固定 602
14.1.3 辅助方案1成年小鼠的灌注 603
14.1.4 辅助方案2蜡块中样本的切片 604
14.1.5 辅助方案3包被载玻片的制备 605
14.2 冰冻切片 605
14.2.1 基本方案样本制备及切片 606
14.2.2 辅助方案1用于原位杂交的冰冻切片的固定 608
14.2.3 辅助方案2组织固定和蔗糖灌注 609
14.3 细胞RNA的原位杂交 609
14.3.1 基本方案细胞的石蜡切片杂交实验 610
14.3.2 备择方案冰冻切片的杂交 613
14.3.3 辅助方案1合成35S-标记的核糖核酸探针 614
14.3.4 辅助方案2 35S标记的双链DNA探针的合成 616
14.4 杂交探针的检测 616
14.4.1 基本方案1胶片放射自显影 616
14.4.2 基本方案2乳胶放射自显影 616
14.4.3 辅助方案放射自显影用稀释乳胶的制备 617
14.5 放射自显影原位杂交玻片的复染和压片固定 618
14.5.1 基本方案吉姆萨（Giemsa）染色 618
14.5.2 备择方案1苏木精／伊红染色 619
14.5.3 备择方案2甲苯胺蓝染色 620
14.5.4 备择方案3 HOECHST染色法 620
14.6 免疫组织化学法 621
14.6.1 基本方案1单层生长细胞的免疫荧光标记 623
14.6.2 备择方案1悬浮细胞的免疫荧光标记 623
14.6.3 基本方案2组织切片的免疫荧光标记 624
14.6.4 备择方案2链霉亲和素生物素结合物免疫荧光标记 625
14.6.5 备择方案3组织切片的免疫金标记 626
14.6.6 备择方案4组织切片的免疫过氧化物酶标记 626
14.6.7 备择方案5组织切片的免疫荧光双标记法 627
14.7 用非同位素探针进行原位杂交和检测 627
14.7.1 基本方案荧光原位杂交 627
14.7.2 杂交信号的放大 629
14.7.3 非同位素标记探针的酶法检测 631
14.8 原位PCR和杂交检测低丰度的靶核酸 633
14.8.1 总体设计 633
14.8.2 基本方案1用RNA的原位逆转录进行DNA和RNA靶序列的ISPCR扩增 636
14.8.3 备择方案一步法逆转录及扩增 640
14.8.4 基本方案2 ISPCR扩增的靶产物的杂交和检测 641
14.8.5 辅助方案1 AES浸泡处理载玻片的制备 644
14.8.6 辅助方案2在载玻片上制备原位PCR样本 645
14.8.7 辅助方案3用33P标记寡核苷酸探针 646
14.9 RNA在脊椎动物的胚胎和器官中的整体标本原位杂交和检测 646
14.9.1 基本方案1小鼠或者鸡的胚胎以及器官中的整体原位杂交 647
14.9.2 基本方案2小鼠胚、鸡胚或者器官中RNA杂交的酶学检测 648
14.9.3 备择方案1非洲爪蟾的整体原位杂交 650
14.9.4 备择方案2非洲爪蟾胚胎RNA杂交的酶学检测 652
14.9.5 辅助方案1地高辛标记的RNA探针的合成 653
14.9.6 辅助方案2用胚胎预吸收Fab片段 654
14.10 荧光显微镜的原理及使用 655
14.10.1 荧光分子探针 657
14.10.2 滤光器以及滤光设备 657
14.10.3 多频带的滤镜和多燃料荧光 658
14.10.4 光源 658
14.10.5 显微镜的物镜 659
14.10.6 图片分辨率和点散布函数（PSF） 659
14.10.7 活细胞的荧光显微镜检术 660
14.10.8 免疫标记：标记固定细胞和组织的一般步骤 661
14.11 共聚焦显微术基本原理 664
14.11.1 光分割的原理 666
14.11.2 共聚焦显微镜的类型 667
14.11.3 实际操作指南 669
14.12 原位杂交的测量 675
14.12.1 基本方案通过磷光核存储影像决定原位杂交中的放射性同位素标记的异源双链体的分布 675
14.12.2 辅助方案制备参考体系 677
14.13 细胞凋亡的形态：生化性质和流式细胞仪检测 678
14.13.1 基本方案1使用活体荧光染料的显微镜定量凋亡指数和细胞活力 678
14.13.2 基本方案2用次G0/G1DNA峰值计算细胞凋亡 680
14.13.3 基本方案3用TUNEL流式细胞定量凋亡细胞 681
14.13.4 基本方案4通过TUNEL组织切面中的凋亡细胞的原位杂交 683
14.14 β-半乳糖苷酶活性的整体封片免疫组化检测 684
14.14.1 基本方案 β-半乳糖苷酶活性的整体封片染色和免疫组化检测 684
14.14.2 备择方案准备大组织的厚切片进行β-半乳糖苷酶染色 686
14.14.3 辅助方案1保存和组织清洗 686
14.14.4 辅助方案2石蜡包埋、切片和染色 687
第15章 聚合酶链反应（PCR） 689
15.1 PCR扩增DNA：标准程序和优化 690
基本方案PCR扩增DNA：标准程序和优化 690
15.2 利用PCR产物直接进行DNA序列测定 696
15.2.1 基本方案1不对称PCR产生的单链产物的双脱氧测序 697
15.2.2 备择方案1单引物重复扩增制备单链模板以用于双脱氧测序 697
15.2.3 备择方案2制备用于双脱氧测序的双链PCR产物 698
15.2.4 备择方案3用λ噬菌体外切核酸酶消化双链PCR产物得到单链进行双脱氧测序 699
15.2.5 基本方案2用于化学测序的PCR产物的标记 699
15.2.6 备择方案4 PCR产物的基因组测序 700
15.3 用于基因组测序及足迹分析的连接介导PCR 701
15.3.1 基本方案连接介导的单侧PCR 701
15.3.2 辅助方案1从单层细胞制备用于DMS足迹分析的基因组DNA 705
15.3.3 辅助方案2从悬浮细胞中制备用于DMS足迹分析的基因组DNA 708
15.3.4 辅助方案3用于化学测序的基因组DNA的制备 709
15.4 PCR产物的分子克隆 711
15.4.1 基本方案产生T-A凸出端 711
15.4.2 备择方案产生半位点 713
15.5 PCR扩增RNA（RT-PCR） 714
15.5.1 基本方案在最适条件下进行RNA的PCR扩增 714
15.5.2 备择方案1避免长时间的共沉淀及复性步骤的方法 716
15.5.3 备择方案2将cDNA直接用于扩增步骤 716
15.5.4 辅助方案粗制RNA的快速提取 717
15.6 利用单侧PCR（锚式PCR）进行cDNA扩增 717
15.6.1 基本方案1扩增已知序列的下游（3′端）区段 717
15.6.2 基本方案2扩增已知序列上游（5′端）区段 721
15.7 通过PCR方法对微量DNA进行定量分析 723
基本方案 723
第16章 蛋白质的表达 726
16.1 蛋白质在大肠杆菌中的表达概述 727
16.2 T7噬菌体RNA聚合酶／启动子表达系统 730
16.2.1 基本方案用双质粒系统进行表达 730
16.2.2 备择方案1质粒编码蛋白的选择性标记 732
16.2.3 备择方案2通过M13噬菌体mGP1-2感染的表达 733
16.3 融合蛋白载体表达概述 734
16.4 融合蛋白的酶解和化学裂解 736
16.4.1 基本方案1用Xa因子进行融合蛋白的酶解 736
16.4.2 辅助方案用Xa因子进行变性融合蛋白的裂解 737
16.4.3 备择方案1用凝血酶进行融合蛋白的酶解 738
16.4.4 备择方案2与分离介质结合的GST融合蛋白的酶解 738
16.4.5 备择方案3用肠激酶进行融合蛋白的酶解 739
16.4.6 基本方案2用溴化氰对融合蛋白进行化学降解 740
16.4.7 备择方案4用羟胺化学裂解融合蛋白 741
16.4.8 备择方案5低pH下水解融合蛋白进行化学裂解 741
16.5 谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白的表达及纯化 742
基本方案谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白的表达及纯化 742
16.6 硫氧还蛋白融合蛋白的表达和纯化 745
16.6.1 基本方案硫氧还蛋白融合蛋白的构建和表达 745
16.6.2 辅助方案1用弗氏细胞压碎器裂解大肠杆菌 748
16.6.3 辅助方案2硫氧还蛋白融合蛋白的渗透性释放 750
16.6.4 辅助方案3用热处理纯化硫氧还蛋白 750
16.7 杆状病毒表达系统的概述 751
杆状病毒表达系统 751
昆虫细胞中蛋白质的翻译后修饰 753
用杆状病毒表达系统超量表达蛋白质的步骤 753
选择杆状病毒转移载体 753
16.8 昆虫细胞培养的保存及重组杆状病毒的产生 757
16.8.1 基本方案1昆虫细胞的保存和培养 757
16.8.2 基本方案2用线性化杆状病毒DNA共转染昆虫细胞 759
16.8.3 备择方案用野生型杆状病毒DNA共转染产生重组病毒 761
16.8.4 基本方案3杆状病毒储液的制备 764
16.8.5 基本方案4用噬斑试验测定病毒储液的滴度 765
16.9 用杆状病毒系统表达和纯化重组蛋白 767
16.9.1 基本方案1用于最初分析的小规模表达 767
16.9.2 辅助方案1蛋白质生产高峰期的确定 768
16.9.3 辅助方案2重组蛋白的代谢标记 769
16.9.4 基本方案2重组蛋白的大规模生产 770
16.9.5 基本方案3含有多聚组氨酸（6×His）标签重组蛋白的纯化 771
16.9.6 备择方案含有GST标签重组蛋白的纯化 772
16.10 概述：蛋白质在哺乳动物细胞中表达 773
16.10.1 病毒介导的基因转移 774
16.10.2 瞬时表达 775
16.11 用COS细胞瞬时表达蛋白质 778
基本方案 778
16.12 痘苗病毒表达系统概述 780
16.13 细胞系和痘苗病毒储液的制备 783
16.13.1 基本方案1贴壁细胞的培养 784
16.13.2 基本方案2悬浮细胞的培养 785
16.13.3 基本方案3痘苗病毒储液的制备 786
16.13.4 辅助方案1噬斑分析测定痘苗病毒储液的滴度 787
16.13.5 基本方案4鸡胚成纤维细胞的制备 788
16.13.6 基本方案5 MVA病毒储液的制备 789
16.13.7 辅助方案2用免疫染色法滴定MVA病毒 790
16.14 重组痘苗病毒的制备 792
16.14.1 基本方案1痘苗载体转染（痘苗病毒）感染的细胞 792
16.14.2 辅助方案1痘苗病毒的纯化 796
16.14.3 辅助方案2痘苗病毒DNA的提取 798
16.14.4 基本方案2筛选重组病毒噬斑 799
16.14.5 基本方案3噬斑扩增 801
16.14.6 基本方案4重组MVA的活体免疫染色 803
16.14.7 辅助方案3用刀豆蛋白A包被组织培养板 804
16.15 重组痘苗病毒及其产物的鉴定 804
16.15.1 基本方案1应用PCR方法检测痘苗DNA 805
16.15.2 基本方案2应用Southern杂交检测痘苗病毒DNA 807
16.15.3 基本方案3应用斑点杂交检测痘苗病毒DNA 808
16.15.4 备择方案应用点印迹检测表达的蛋白质 809
16.15.5 基本方案4应用免疫印迹检测表达蛋白 810
16.15.6 基本方案5应用免疫沉淀检测表达蛋白 811
16.16 用痘苗病毒／T7 RNA聚合酶系统表达基因 812
16.16.1 基本方案1重组痘苗病毒（vTF7-3）感染后的脂质体转染 813
16.16.2 基本方案2两种重组痘苗病毒共感染细胞 815
16.16.3 基本方案3单病毒感染OST7-1细胞 816
16.16.4 基本方案4利用VOTE系统进行基因表达 817
16.16.5 辅助方案脉冲标记检测表达的蛋白质 818
16.17 自主调节的四环素控制系统诱导基因表达 819
16.17.1 基本方案磷酸钙介导的pTet-tTAK稳定转染NIH3T3细胞和四环素调控的靶质粒 820
16.17.2 辅助方案分析目的基因的蛋白质表达 823
16.18 从哺乳动物细胞中表达和纯化抗原决定簇标记的多亚基蛋白复合体 825
16.18.1 基本方案1从组成型表达FLAG标记蛋白的克隆化细胞系中纯化多亚基蛋白复合物 826
16.18.2 基本方案2从条件性表达FLAG标记蛋白的克隆化细胞系中纯化多亚基蛋白复合体 829
16.18.3 备择方案变化起始材料和洗脱条件纯化抗原表位标记蛋白复合体的多种形式 831
16.18.4 辅助方案用P11离子交换层析柱纯化多种形式的抗原表位标记的蛋白复合体 834
第17章 蛋白质磷酸化的分析 836
17.1 蛋白质磷酸化概述 837
17.2 32Pi标记培养细胞和制备用于免疫沉淀的细胞裂解物 838
17.2.1 基本方案培养细胞的32Pi标记和温和去垢剂裂解法 838
17.2.2 备择方案SDS煮沸法裂解细胞 840
17.3 磷酸氨基酸分析 841
17.3.1 基本方案磷酸氨基酸的酸水解和双向电泳分析 841
17.3.2 备择方案 碱处理提高转移至滤膜上的含磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸的蛋白质的检测灵敏度 844
17.4 分析非标记蛋白质的磷酸化作用 845
17.4.1 基本方案1用抗磷酸酪氨酸抗体和125I标记蛋白A进行免疫印迹分析 845
17.4.2 备择方案用增强化学发光法（ECL）检测结合的抗体 846
17.4.3 基本方案2磷酸酶消化法鉴定磷酸化的蛋白质 847
17.5 酶法检测磷酸化作用 848
17.5.1 基本方案1用非特异酸性磷酸酶消化磷酸蛋白质 848
17.5.2 备择方案1用非特异碱性磷酸酶消化磷酸蛋白质 849
17.5.3 基本方案2用丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酶消化磷酸蛋白质 850
17.5.4 备择方案2用酪氨酸磷酸酶消化磷酸蛋白质 850
17.5.5 辅助方案离解32P的测量和鉴定 851
17.6 特异性识别酪氨酸磷酸化肽的抗体的制备 851
17.6.1 基本方案1抗磷酸肽的多克隆抗体的制备 851
17.6.2 基本方案2抗磷酸肽的单克隆抗体的制备 854
17.6.3 辅助方案1肽的合成 856
17.6.4 辅助方案2将肽链交联到AFFI-GEL10亲和介质上 856
17.6.5 辅助方案3将磷酸酪氨酸交联到AFFI-GEL 10亲和介质上 858
17.7 用外源性底物分析蛋白激酶 859
17.7.1 基本方案1环核苷酸依赖性蛋白激酶的分析 861
17.7.2 基本方案2蛋白激酶C异构体的分析 862
17.7.3 基本方案3用β-酪蛋白进行酪蛋白激酶的分析 863
17.7.4 备择方案用多肽底物进行酪蛋白激酶的分析 863
17.7.5 基本方案4 Ca2＋／钙调蛋白依赖性激酶的分析 864
17.7.6 基本方案5酪氨酸激酶的分析 865
17.7.7 基本方案6在凝胶中直接进行激酶的分析 866
17.7.8 辅助方案1用于激酶分析的细胞裂解方案 867
17.7.9 辅助方案2三氯乙酸沉淀法测定放射性物质的掺入率 868
17.7.10 辅助方案3 P81磷酸纤维素膜的吸附 868
17.8 研究蛋白质磷酸化的渗透策略 870
17.8.1 基本方案用渗透细胞进行蛋白磷酸化的分析 871
17.8.2 备择方案1用于SDS-PAGE的天然细胞样品制备 873
17.8.3 备择方案2制备用于等电聚焦的天然细胞样品 874
17.9 磷酸肽图谱和磷酸化位点的鉴定 874
17.9.1 基本方案1用SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白质的胰蛋白酶磷酸肽图谱 875
17.9.2 备择方案固相化蛋白质的水解消化 881
17.9.3 辅助方案1从纤维素平板上提取磷酸肽 882
17.9.4 基本方案2用手工EDMAN降解法测定肽中磷酸化氨基酸的位置 883
17.9.5 基本方案3第二次鉴别性消化以检测磷酸肽中特定氨基酸的存在 885
17.9.6 辅助方案2用于微序列测定或质谱的磷酸肽的制备 886
第18章 生物信息学 888
18.1 用BLAST程序组进行序列相似性搜索 888
18.1.1 B LAST概述 889
18.1.2 搜索策略 907
第19章 蛋白质相互作用的分析 912
19.1 利用相互作用阱／双杂交系统鉴定相互作用蛋白 915
19.1.1 基本方案1鉴定诱饵蛋白 916
19.1.2 基本方案2相互作用蛋白的捕获 923
19.1.3 备择方案1相互作用阱的快速筛选 931
19.1.4 备择方案2通过相互作用交配进行捕获实验 932
19.1.5 辅助方案1用于免疫印迹分析的蛋白质提取物的制备 934
19.1.6 辅助方案2制备鲑精载体DNA 935
19.2 与GST融合蛋白结合的蛋白质的亲和纯化 937
19.2.1 基本方案GST融合蛋白的亲和纯化 937
19.2.2 辅助方案E.coli提取物的制备 939
19.3 基于噬菌体表达克隆来确认相互作用蛋白质 940
基本方案相互作用克隆 941
19.4 表面等离子共振技术 944
19.4.1 基本方案1使用BIAcore芯片的表面等离子共振 944
19.4.2 基本方案2使用NTA-SAM 芯片的表面等离子共振 946
19.5 用共沉淀法检测蛋白质蛋白质之间的相互作用 946
19.5.1 基本方案用蛋白A/G-琼脂糖共沉淀蛋白 946
19.5.2 备择方案用GST融合蛋白共沉淀 947
19.6 用Far Western分析识别蛋白质相互作用 948
19.6.1 基本方案用Far Western分析蛋白质混合物 949
19.6.2 备择方案1用免疫印迹技术检测相互作用蛋白质 950
19.6.3 备择方案2在Far Western blot 中用多肽检测特定的相互作用序列 951
第20章 染色质的装配与分析 953
20.1 微球菌核酸酶分析染色质结构 954
20.1.1 基本方案1渗透化细胞的染色质的微球菌核酸酶消化 954
20.1.2 基本方案2分离的细胞核的染色质的微球菌核酸酶消化 955
20.1.3 基本方案3纯化的基因组DNA的微球菌核酸酶消化 957
20.1.4 辅助方案1染色质消化得到的DNA的纯化和鉴定 957
20.1.5 辅助方案2核酸酶切割图谱分析策略 959
20.1.6 辅助方案3使用改进的LM-PCR方法在核苷酸水平上检测MNase对双链的切割 961
20.2 分离Triton／乙酸／尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分离组蛋白变体和翻译后修饰异构体 962
20.2.1 基本方案组蛋白的Triton／乙酸／尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 963
20.2.2 辅助方案1凝胶板的组装 964
20.2.3 辅助方案2从制备的核中分离组蛋白 965
20.2.4 辅助方案3 TAU-聚丙烯酰胺凝胶的电转移 966
20.3 用免疫共沉淀的方法从总细胞抽提物中确定与染色质结合的蛋白质 967
基本方案用免疫共沉淀的方法从细胞总抽提物中确定与染色质结合的蛋白质 967
20.4 从哺乳动物细胞中分离组蛋白和核小体核心 971
20.4.1 基本方案1精核的制备 971
20.4.2 基本方案2去H1的寡聚核小体的溶解和纯化 972
20.4.3 基本方案3单聚及二聚核小体的纯化 974
20.4.4 基本方案4羟磷灰石层析法纯化核心组蛋白 975
20.5 用盐透析的方法组装核小体模板 975
20.5.1 基本方案1用逐步盐透析的方法组装核小体模板 976
20.5.2 基本方案2用梯度盐透析的方法组装高浓度的单核小体 977
20.5.3 基本方案3用梯度盐透析的方法组装核小体串 978
20.5.4 辅助方案1细菌的重组核心组蛋白的纯化 979
20.5.5 辅助方案2用于单核小体组装的单链5′端标记的DNA的制备 980
20.5.6 辅助方案3用于组装高浓度非标记的单核小体的DNA的制备 981
20.5.7 辅助方案4用于核小体串组装的DNA的制备 982
20.5.8 辅助方案5用琼脂糖凝胶电泳分析重建复合体 982
20.5.9 辅助方案6用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析重建复合体 983
20.5.10 辅助方案7通过EcoRI消化确定G5E4核小体串组装的范围 983
20.6 使用果蝇系统进行染色质重组 984
20.6.1 基本方案1果蝇S-190染色质重组抽提物的制备 984
20.6.2 基本方案2从果蝇胚胎中纯化核心组蛋白 985
20.6.3 基本方案3用S-190抽提物进行染色质重组 988
20.6.4 基本方案4重组的果蝇ACF的表达和纯化 990
20.6.5 基本方案5重组的果蝇NAP-1的表达和纯化 991
20.6.6 备择方案1重组的果蝇NAP-1的表达和纯化（NTA Surperflow树脂） 993
20.6.7 基本方案6使用重组的果蝇因子进行染色质装配 993
20.6.8 备择方案2重组染色质装配反应中的核心组蛋白与DNA比率的滴定 995
20.6.9 辅助方案果蝇拓扑异构酶Ⅰ的核心催化区域的表达和纯化 996
第21章 核酸阵列 998
21.1 核酸阵列概述 998
21.1.1 微阵列擅长做什么？ 998
21.1.2 核酸阵列还能够做什么？ 1000
21.1.3 关于数据分析 1001
21.1.4 哪里有更多的信息？ 1002
21.2 用于表达分析的mRNA的制备 1003
21.2.1 策略安排 1003
21.2.2 基本方案用于表达监测以及与寡核苷酸芯片杂交的mRNA扩增 1004
21.2.3 辅助方案1对照基因的体外转录和转录库的制备 1008
21.2.4 备择方案cDNA和体外转录产物的固相可逆固定（SPRI）纯化 1010
21.2.5 辅助方案2 cDNA定量 1011
21.3 用cDNA阵列技术检测人的基因表达谱 1012
21.3.1 基本方案1 cDNA扩增和影印 1012
21.3.2 基本方案2 RNA抽提和标记 1016
21.3.3 基本方案3杂交和数据处理 1019
21.3.4 辅助方案1 EST的琼脂糖凝胶电泳 1021
21.3.5 辅助方案2荧光法测定DNA浓度 1023
21.3.6 辅助方案3多聚赖氨酸封闭玻片 1023
第22章 组合文库的建立和使用 1025
22.1 构建组合库及文库所用的DNA库的设计、合成和扩增 1025
22.1.1 基本方案1随机序列库的纯化 1025
22.1.2 辅助方案1库的复杂度的测定 1026
22.1.3 辅助方案2库的偏好性的测定 1028
22.1.4 辅助方案3库扩增的小规模PCR反应的优化 1028
22.1.5 基本方案2库DNA的大规模扩增 1029
22.2 肽适配体：用于细胞过程的正向及反向分析的显性遗传学试剂 1031
22.2.1 基本方案1构建硫氧还蛋白肽适配体组合库 1031
22.2.2 基本方案2利用双杂交系统相互作用阱／筛选特定蛋白的肽适配体 1033
22.2.3 基本方案3通过相互作用交配确定识别特异性 1035
22.2.4 基本方案4肽适配体的亲和力成熟 1036
22.2.5 基本方案5用肽适配体正向分析细胞过程 1038
22.2.6 辅助方案肽适配体靶点的鉴定 1039
22.3 利用mRNA显示法进行蛋白筛选 1040
22.3.1 基本方案1制备和纯化mRNA显示蛋白 1040
22.3.2 基本方案2 mRNA显示蛋白的纯化和逆转录 1044
22.3.3 基本方案3 mRNA显示蛋白的筛选与扩增 1046
22.3.4 辅助方案1 FLAG标签的纯化 1050
22.3.5 辅助方案2诱导突变PCR 1050
第23章 单个细胞或一群细胞间差异表达基因的发现和分析 1052
23.1 差减cDNA文库的建立 1052
基本方案差减cDNA文库的构建 1052
23.2 基于PCR的差减cDNA克隆 1056
23.2.1 基本方案差减cDNA文库的构建 1056
23.2.2 辅助方案狭缝斑点杂交监测差减过程 1062
23.3 mRNA的PCR差异显示 1064
基本方案mRNA的PCR差异显示 1064
23.4 限制性内切核酸酶介导的差异显示（RMDD） 1067
23.4.1 基本方案RMDD文库的准备和两轮扩增 1068
23.4.2 备择方案两阶段PCR扩增 1073
23.4.3 辅助方案直接印迹电泳 1074
23.5 基于AFLP的转录表达谱分析 1077
基本方案基于AFLP的转录表达谱分析 1077
23.6 基因表达系列分析（SACE） 1083
23.6.1 基本方案基因表达系列分析（SAGE） 1083
23.6.2 辅助方案1 PCR验证cDNA产物 1094
23.6.3 辅助方案2优化双标签的PCR扩增 1095
附录1试剂和溶液 1097
附录2实用测量值和数据 1247
附录3生物化学和分子生物学常用技术 1264
附录3A凝胶和印迹实验中放射性标记蛋白和DNA的检测及定量 1264
附录3B玻璃器皿的硅化 1271
附录3C透析与超滤 1271
附录3D用吸收光谱法和荧光光谱法定量DNA和RNA 1277
附录3E通过沉默突变引入限制性内切核酸酶识别位点 1280
附录3F哺乳动物细胞组织培养技术 1282
附录3G安全使用放射性同位素 1290
附录3H分子生物学家的统计学：组比较 1300
附录4试剂和设备的供应商 1323
附录5参考文献 1368
索引 1385