第1章 RNA纳米技术方法综述——RNA纳米颗粒的合成、纯化及特性 1
1 RNA纳米技术的定义 1
2 构建多功能RNA纳米颗粒 2
2.1 纳米颗粒的RNA支架组装 4
2.2 合并功能模块为RNA纳米颗粒 7
3 多功能RNA纳米颗粒的纯化和特征 11
3.1 凝胶移位分析 11
3.2 超速离心法 11
3.3 高效液相色谱法 12
3.4 RNA纳米颗粒的结构特征 12
3.5 RNA纳米颗粒的功能试验 13
4 展望 13
5 结论 14
致谢 14
参考文献 14
第2章 调查细菌小调控RNA自我组装的多种方法 19
1 引言 19
2 材料 23
2.1 试剂 23
2.2 缓冲液和溶液 23
3 方法 24
3.1 用于聚合作用研究的小非编码RNA（sRNA）的体外转录 24
3.2 电泳分析sRNA的自组装 25
3.3 二级结构预测和sRNA自组装最小序列的特征 25
3.4 热变性分析 26
3.5 利用近红外光谱分析碱基配对 28
3.6 sRNA组装的分子成像 30
3.7 粗提物中sRNA聚合物的检测 33
3.8 非编码sRNA的RT-PCR定量分析 34
3.9 结论 35
4 注释 36
致谢 36
参考文献 36
第3章 使用AFM测量包含核糖核苷酸的DNA分子的弹性 40
1 引言 40
2 材料 42
2.1 寡核苷酸 42
2.2 寡核苷酸上硫醇基的去保护 43
2.3 原子力显微镜底衬的制备 43
2.4 制备镀金的羧基修饰的氮化硅悬臂 43
2.5 在金表面固定DNA底衬 43
2.6 原子力显微镜液体电池 44
2.7 原子力显微镜和配件 44
3 方法 44
3.1 制备含核糖核苷一磷酸的DNA寡核苷酸 44
3.2 制备双链嵌入式-核糖核苷一磷酸DNA基质 45
3.3 制备镀金羧基修饰氮化硅悬臂及含核糖核苷一磷酸的DNA基质的固定化 45
3.4 用于测量力的原子力显微镜的校准 46
3.5 原子力显微镜液体电池的清洁 47
3.6 利用原子力显微镜力光谱测量双链含核糖核苷一磷酸的DNA的弹性 47
3.7 数据分析 48
4 注释 50
致谢 51
参考文献 51
第4章 RNA纳米技术之银纳米簇：RNA纳米颗粒组装的观察以及跟踪的步骤 55
1 引言 55
2 材料 56
2.1 转录和RNA纳米颗粒组装成分 56
2.2 Ag:RNA成分 57
3 方法 57
3.1 RNA合成 57
3.2 RNA纳米立方体的组装 57
3.3 RNA组装的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳实验 58
3.4 合成Ag:RNA 58
3.5 Ag:RNA光学测量 58
4 注释 59
致谢 60
参考文献 61
第5章 利用制备性超速离心大规模纯化RNA纳米颗粒 63
1 引言 63
2 材料 67
2.1 梯度准备 67
2.2 超速离心 68
2.3 分馏和样品分析 68
3 方法 69
3.1 CsCl平衡密度法纯化RNA 69
3.2 速率区带蔗糖梯度法分离纳米颗粒 70
3.3 分馏和样品分析／回收（CsCl和蔗糖的相同） 72
3.4 预期结果 73
4 注释 73
致谢 75
参考文献 75
第6章 HPLC纯化长达59个核苷酸具有单核苷酸分辨率的RNA适配体 78
1 引言 78
2 材料 80
2.1 RNA样品 80
2.2 HPLC仪器 81
2.3 试剂和缓冲液 81
3 方法 81
3.1 配制缓冲液 81
3.2 初始化和平衡柱子 81
3.3 上样 82
3.4 再平衡柱子 83
3.5 样品处理 83
4 注释 83
参考文献 87
第7章 在原核和真核细胞中利用具有热力学稳定基序和荧光模块的RNA纳米颗粒实时检测RNA的折叠和翻转 89
1 引言 89
2 材料 91
2.1 体外转录和纯化RNA 91
2.2 在E.coli中表达RNA 92
2.3 体外和体内MG/DFHBI结合分析 93
2.4 动物及人类细胞中RNA表达、折叠和降解的荧光成像 93
3 方法 94
3.1 融合RNA纳米颗粒的设计 94
3.2 通过T7 RNA聚合酶体外转录制备RNA纳米颗粒并用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化RNA 95
3.3 利用细菌表达、装配和纯化RNA纳米颗粒 95
3.4 通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳体外评估RNA折叠 96
3.5 通过MG分析，体外评估RNA的折叠 98
3.6 通过DHBFI结合分析，体外评估RNA折叠 98
3.7 体外监测RNA降解 98
3.8 细菌体内RNA折叠的评估 98
3.9 真核细胞中RNA折叠的评估 99
3.10 在动物和人类细胞中实时检测RNA纳米颗粒半衰期 100
4 注释 101
致谢 103
参考文献 103
第8章 小RNA 3′端氧化的荧光标记 105
1 引言 105
2 材料 106
2.1 体外转录组分 106
2.2 标记组分 107
2.3 凝胶阻滞成分 107
3 方法 107
3.1 体外转录 107
3.2 RNA标记 108
3.3 凝胶阻滞分析 109
4 注释 109
致谢 110
参考文献 111
第9章 RNA纳米颗粒对转移性肿瘤靶向定位及给药的方法和分析 112
1 引言 112
2 材料 113
2.1 试剂 114
2.2 设备 115
2.3 试剂配制（见注释1） 116
3 方法 117
3.1 三叉接口（3WJ）自我装配 117
3.2 通过激光共聚焦显微镜试验pRNA-3WJ纳米颗粒的细胞结合和内化 118
3.3 通过流式细胞仪（FACS）实验检测pRNA-3WJ纳米颗粒的细胞结合（可选） 118
3.4 为了产生小鼠皮下移植瘤，皮下注射肿瘤细胞（图9-3） 119
3.5 为了产生转移瘤小鼠模型，在脾内注射肿瘤细胞 119
3.6 靶肿瘤细胞中荧光RNA纳米颗粒的IVIS光谱在体成像（见注释13） 120
3.7 靶标肿瘤组织中RNA荧光纳米颗粒的微观成像 122
3.8 用流式细胞仪分析新鲜组织（可选） 122
4 注释 123
致谢 124
参考文献 124
第10章 RNA纳米颗粒在脑瘤中靶向给药的功能性试验 127
1 引言 127
2 材料 128
2.1 材料 128
2.2 设备 129
2.3 试剂配制 130
3 方法 131
3.1 体内合成RNA以及构建RNA纳米颗粒 131
3.2 用原子力显微镜成像显示RNA纳米颗粒的结构 131
3.3 流式细胞仪分析体外检测叶酸介导的人脑瘤细胞定位（图10-2） 133
3.4 荧光共聚焦显微镜体外检测叶酸介导的人癌细胞定位（图10-3） 134
3.5 向小鼠模型系统中移植脑瘤（图10-4） 135
3.6 利用核磁共振成像（MRI）对小鼠植入脑瘤的定位并测量大小（图10-4） 135
3.7 患有脑瘤小鼠的间接体内荧光成像（图10-5） 136
3.8 siRNA给药后体内生物荧光全身成像检测脑瘤（图10-6） 137
4 注释 138
致谢 140
参考文献 140
第11章 适配体介导的纳米颗粒相互作用：从寡核苷酸-蛋白质复合体到SELEX筛选 142
1 引言 142
2 材料 144
2.1 流感病毒基质蛋白-1 144
2.2 寡聚核苷酸合成和纯化 144
2.3 自动化的SELEX 145
2.4 RNA候选的自动化合成 145
2.5 AlphaScreen？试验 145
3 方法 146
3.1 SELEX 146
3.2 C6（36）适配体的特性：AlphaScreen？的M1复合体 146
3.3 C1（36）-M1分析 149
3.4 C1（36）-M1-C6（36）夹心试验 149
3.5 HAPIscreen 151
4 注释 154
致谢 154
参考文献 154
第12章 通过黏性桥组合特异性的适配体-siRNA纳米颗粒的方法内化B细胞淋巴瘤 157
1 引言 157
2 材料 159
2.1 细胞系 159
2.2 通过体外转录合成BAFF-R R-1和HIV-1 gp120 A-1对照适配体 160
2.3 适配体-黏性-siRNA纳米颗粒的结构 161
2.4 通过凝胶迁移试验确定分离常数 161
2.5 通过激光共聚焦显微镜分析细胞内化 162
2.6 RNA抽提 162
2.7 利用RT-PCR进行基因沉默 162
2.8 通过MTS试验和流式细胞术分析细胞增殖及凋亡 163
2.9 siRNA的电转化 163
3 方法 163
3.1 通过体外转录的BAFF-R R-1和HIV-1 gp120 A-1控制适配体的合成 164
3.2 BAFF-R R-1适配体-黏性-STAT3 siRNA纳米颗粒的产生 164
3.3 利用凝胶迁移试验测定分离常数 164
3.4 利用激光共聚焦显微镜分析细胞内化 166
3.5 通过定量RT-PCR分析STAT3 siRNA功能 167
3.6 通过MTS试验分析细胞增殖 168
3.7 利用流式细胞法分析细胞凋亡 168
4 注释 169
致谢 170
参考文献 170
第13章 一种用于在人黑色素瘤细胞中剪接转换寡核苷酸的功能运输的高通量筛选方法 173
1 引言 173
2 材料 175
2.1 A375 pLuc细胞培养和SSO转染 175
2.2 荧光素酶检测 175
2.3 RT-PCR检测 175
3 方法 176
3.1 A375 pLuc细胞培养和SSO转染步骤（见注释9） 176
3.2 荧光素酶检测 176
3.3 RNA提取和RT-PCR（见注释10） 177
4 注释 179
参考文献 180
第14章 RNA-蛋白纳米结构的设计、组装和评估 182
1 引言 182
2 材料 184
2.1 设计 184
2.2 合成 185
2.3 电泳迁移率试验 186
2.4 大气中原子力显微镜 186
3 方法 187
3.1 设计 187
3.2 合成 188
3.3 电泳迁移率试验（EMSA） 190
3.4 大气中原子力显微镜（AFM） 191
4 注释 192
致谢 194
参考文献 194
第15章 利用CLIP-Seq技术在病毒中定位RNA和蛋白质的相互作用 196
1 引言 196
2 材料 199
2.1 交联和免疫沉淀组分 199
2.2 RNA片段化和提取试剂 200
2.3 cDNA文库构建及序列组成 200
3 方法 200
3.1 紫外交联和RNA片段化 200
3.2 免疫沉淀反应和RNA提取 201
3.3 cDNA文库构建 203
3.4 数据分析 204
4 注释 205
致谢 205
参考文献 206
第16章 用RCAP、RNA交联和肽段指纹识别技术定位蛋白质-RNA相互作用 208
1 引言 208
1.1 RCAP 209
1.2 甲醛交联 209
1.3 亲和捕获RNA 210
1.4 质谱分析 211
1.5 数据分析 211
1.6 RCAP数据的独立确定 212
2 材料 213
2.1 RCAP试验：交联和胰蛋白酶消化试剂 213
2.2 RCAP试验：RNA沉淀和重悬浮 213
2.3 样品清除 214
3 方法 214
3.1 RCAP试验：RNA-多肽复共轭对配合物的制备 214
3.2 RCAP试验：RNA-肽段复共轭对配合物的沉淀和再悬浮 214
3.3 样品处理和质谱分析 215
4 注释 215
致谢 216
参考文献 216