第1章 临床PCR技术的发展历史及趋势 1
第一节 PCR的起源和耐热DNA聚合酶的应用 1
一、PCR的起源 1
二、耐热DNA聚合酶的应用 2
第二节 PCR的基本原理 3
第三节 PCR的反应动力学 5
第四节 PCR的扩增体系和扩增条件 5
一、PCR扩增体系的基本要素 5
二、PCR的标准扩增体系 8
三、PCR扩增的增强剂 9
四、降落PCR 9
五、热启动PCR 10
六、COLD-PCR 10
七、PCR扩增结果分析 11
第五节 PCR的特点 12
一、高特异性 12
二、高灵敏度 12
三、简便快速 12
四、特定的低纯度标本也可使用 12
第六节 PCR的发展 12
参考文献 13
第2章 实时荧光PCR技术的基本原理和方法 14
第一节 发展历程 14
第二节 基本原理 15
一、PCR扩增的理论模式 15
二、实时荧光PCR的理论基础 16
三、TaqMan实时荧光PCR的基本原理 17
四、双链DNA交联荧光染料实时荧光PCR的基本原理 19
五、双杂交探针实时荧光PCR的基本原理 20
六、分子信标实时荧光PCR的基本原理 20
七、蝎形探针实时荧光PCR的基本原理 21
八、数字实时荧光PCR的基本原理 24
第三节 引物、探针的特点及设计软件 26
一、引物的特点 26
二、探针的特点 26
三、引物和探针设计软件 27
第四节 多重实时荧光PCR 28
参考文献 28
第3章 临床PCR实验室的设计及质量管理体系的建立 30
第一节 实验室的分区规划设计 30
一、标本的接收 30
二、实验室分区设计的一般原则及工作流程 31
第二节 实验室质量管理体系的建立 39
一、实验室质量管理概述 39
二、实验室质量管理的特点 41
三、质量体系文件的编写 42
第三节 实验室的记录管理 56
一、记录的种类 56
二、记录的标识 56
三、记录的填写 57
四、记录的封面和目录 59
五、记录的良好保存 59
六、记录的保存期限 59
七、过期记录的处理 59
八、记录表格样式的持续改进 59
九、电子记录的管理 60
第四节 实验室验收与实验室认可 60
一、实验室认可的由来及目的 60
二、实验室认可与认证的区别 61
三、实验室验收与实验室认可的关系 61
参考文献 62
第4章 临床PCR检验标本的采集、运送、保存及核酸提取 63
第一节 标本采集、运送、保存 63
一、标本采集 63
二、标本运送 65
三、标本保存 65
第二节 常见临床标本的处理和保存 66
一、血清（浆）样本 66
二、全血样本 66
三、外周血单个核细胞 66
四、痰 66
五、棉拭子 67
六、脓液 67
七、体液 68
八、乳汁 68
九、组织 69
第三节 临床标本中PCR抑制物 70
一、临床标本中PCR抑制物的来源及作用机制 70
二、几种常见抑制物的作用机制及对策 70
第四节 核酸的提取方法 72
一、DNA提取的经典方法 72
二、RNA的提取 73
三、核酸提取的改良方法 74
参考文献 78
第5章 实时荧光PCR测定的数据处理 83
第一节 基本概念 83
第二节 实时荧光PCR外标绝对定量的数学模型 85
一、基本计算公式的推导 85
二、纵坐标为起始拷贝数对数值横坐标为Ct时的数学模型 85
三、纵坐标为Ct横坐标为起始拷贝数时的数学模型 86
第三节 实时荧光PCR相对定量的数学模型 87
一、相对定量的标准曲线法 87
二、2-△△Ct法 89
三、2-△△Ct的改良方法 89
四、多重PCR法 91
第四节 用曲线拟合的方法进行数据处理 92
一、Liu与Saint的方法 92
二、Ramakers等的方法 92
三、Tichopad等的方法 92
参考文献 93
第6章 实时荧光PCR仪及其发展 94
第一节 PCR仪的发展历史及基本原理 94
一、空气驱动循环PCR仪 94
二、变温金属块PCR仪 95
第二节 实时荧光PCR仪简介 95
一、美国ABI公司生产的实时荧光PCR仪 95
二、美国Cepheid公司的Smart Cycler实时荧光PCR仪 98
三、美国Bio-Rad公司的实时荧光PCR仪 99
四、美国Stratagene公司的实时荧光PCR仪 100
五、Roche公司的LightCycler实时荧光PCR仪 101
六、Corbert的RotorGene实时荧光PCR仪 103
七、Eppendorf公司的Mastercycler ep realplex实时荧光PCR仪 104
第三节 实时荧光PCR仪选择 104
一、仪器使用的广泛程度 104
二、工作量 104
三、耗材的开放性 105
四、硬件设计特点 105
五、检测通道和可检测的荧光染料 105
六、温度梯度功能 105
七、软件功能 105
第四节 数字PCR仪简介 106
一、微流控芯片数字PCR 107
二、液滴数字PCR 107
第五节 实时荧光PCR仪的使用、维护和校准 108
一、实时荧光PCR仪使用中的注意事项 108
二、维护和校准 108
参考文献 111
第7章 临床PCR检验仪器设备的使用、维护和校准 112
第一节 天平 112
一、电子分析天平及其分类 112
二、天平的正确使用 113
三、天平的选择 114
四、天平的维护和校准 114
第二节 离心机 115
一、离心机离心的基本原理 115
二、离心力和相对离心力 116
三、离心时间 116
四、离心转子的选择 119
五、离心管 119
六、离心机的分类 119
七、离心机的使用和维护 120
第三节 微量加样器 122
一、微量加样器的一般原理及分类 122
二、加样器的选择及使用 123
三、加样器的维护和校准 129
参考文献 133
第8章 临床PCR检验的质量保证 134
第一节 概述 134
一、基本概念 134
二、质量保证、室内质量控制和室间质量评价之间的关系 136
三、标本采集、运送、保存及其质量控制 136
第二节 室内质量控制 137
一、测定前质量控制 137
二、核酸样本的制备、扩增检测及其质量控制 144
三、统计学质量控制 146
第三节 室间质量评价 160
一、室间质量评价的程序设计 161
二、室间质量评价的局限性 164
参考文献 165
第9章 病毒核酸检测的标准物质及其应用 167
第一节 概述 167
一、基本概念 167
二、病毒核酸检测用标准物质的种类和溯源关系 169
第二节 病毒核酸检测用标准物质的制备 170
一、原材料的选择和分装 171
二、均匀性和稳定性 172
三、定值 174
四、标准物质的保存 175
五、核酸检测用标准物质的意义 175
六、核酸检测用标准物质的展望 176
参考文献 179
第10章 甲型肝炎病毒实时荧光PCR检测及临床意义 182
一、HAV的特点 182
二、HAV RNA实时荧光RT-PCR检测 182
三、HAV RNA检测的临床意义 185
参考文献 186
第11章 乙型肝炎病毒实时荧光PCR检测及临床意义 187
一、HBV的特点 187
二、HBV DNA实时荧光PCR测定 190
三、HBV变异的检测及其临床意义 196
四、HBV cccDNA的检测及其临床意义 200
五、HBV基因型的检测及其临床意义 201
六、HBV RNA的检测及其临床意义 204
七、HBV全基因组测定及其临床意义 205
参考文献 206
第12章 丙型肝炎病毒实时荧光RT-PCR检测及临床意义 210
一、HCV的形态和基因组结构特点 210
二、HCV的复制特点 211
三、HCV的变异特点及基因型 211
四、HCV RNA实时荧光RT-PCR测定 212
五、HCV基因分型检测及其临床意义 220
参考文献 223
第13章 人免疫缺陷病毒-1实时荧光RT-PCR检测及临床意义 226
一、HIV-1的特点 226
二、HIV-1 RNA的实时荧光RT-PCR测定 227
三、HIV-1 RNA测定的临床意义 234
参考文献 235
第14章 人乳头瘤病毒实时荧光PCR检测及临床意义 237
一、HPV的形态和基因结构特点 237
二、HPV的体内复制特点 239
三、病毒的变异特点 239
四、HPV基因型 240
五、HPV DNA的实时荧光PCR测定 240
六、HPV DNA检测的临床意义 248
参考文献 250
第15章 巨细胞病毒实时荧光PCR检测及临床意义 253
一、人类巨细胞病毒的特点 253
二、人类巨细胞病毒实时荧光PCR测定 254
三、巨细胞病毒PCR检测的临床意义 267
参考文献 268
第16章 严重急性呼吸综合征冠状病毒实时荧光RT-PCR检测及临床意义 269
一、SARS-CoV的特点 269
二、SARS-CoV RNA实时荧光RT-PCR检测 270
三、SARS-CoV PCR检测的临床意义 286
参考文献 286
第17章 EB病毒实时荧光PCR检测及临床意义 288
一、EB病毒的特点 288
二、EB病毒实时荧光PCR测定 289
三、EB病毒PCR检测的临床意义 294
参考文献 295
第18章 流感病毒实时荧光RT-PCR检测及临床意义 296
一、流感病毒的特点 296
二、流感病毒的实时荧光RT-PCR测定 298
三、流感病毒RT-PCR检测的临床意义 320
参考文献 320
第19章 风疹病毒实时荧光RT-PCR检测及临床意义 321
一、风疹病毒的形态和基因组结构及功能特点 321
二、风疹病毒的复制特点 322
三、风疹病毒的变异特点及基因型 323
四、风疹病毒实时荧光RT-PCR测定及其临床意义 323
参考文献 330
第20章 麻疹病毒实时荧光RT-PCR检测及临床意义 332
一、麻疹病毒的形态和基因组结构及功能特点 332
二、麻疹病毒的复制特点 334
三、麻疹病毒的变异特点及基因型 335
四、麻疹病毒实时荧光RT-PCR测定及其临床意义 335
参考文献 339
第21章 手足口病病原体实时荧光RT-PCR检测及临床意义 341
一、手足口病病原体的形态和基因组结构特点 341
二、手足口病病原体复制特点 341
三、手足口病病原体实时荧光RT-PCR测定及其临床意义 342
四、手足口病病原体检测及其临床意义 349
参考文献 349
第22章 埃博拉病毒实时荧光定量RT-PCR检测及临床意义 351
一、EBOV的形态和基因组结构特点 351
二、EBOV的基因分型 352
三、EBOV RNA实时荧光RT-PCR测定及其临床意义 352
参考文献 360
第23章 中东呼吸综合征冠状病毒实时荧光RT-PCR检测及临床意义 361
一、MERS-CoV的形态和基因组结构特点 361
二、MERS-CoV的感染过程 362
三、MERS-CoV RNA实时荧光RT-PCR测定及其临床意义 363
参考文献 379
第24章 沙眼衣原体实时荧光PCR检测及临床意义 381
一、沙眼衣原体的形态和基因组结构特点 381
二、沙眼衣原体的实时荧光PCR测定 381
三、沙眼衣原体PCR检测的临床意义 391
参考文献 391
第25章 结核杆菌实时荧光PCR检测及临床意义 394
一、结核杆菌的特点 394
二、结核杆菌实时荧光PCR检测 395
三、结核杆菌PCR检测的临床意义 405
参考文献 406
第26章 淋病奈瑟菌实时荧光PCR检测及临床意义 407
一、淋病奈瑟菌的特点 407
二、淋病奈瑟菌实时荧光PCR测定 408
三、淋病奈瑟菌PCR检测的临床意义 418
参考文献 419
第27章 幽门螺杆菌实时荧光PCR检测及临床意义 420
一、幽门螺杆菌的特点 420
二、幽门螺杆菌实时荧光PCR测定 421
三、幽门螺杆菌PCR检测的临床意义 430
参考文献 430
第28章 肺炎支原体实时荧光PCR检测及临床意义 432
一、肺炎支原体的结构特点 432
二、肺炎支原体的实时荧光PCR检测 432
三、肺炎支原体PCR检测的临床意义 437
参考文献 437
第29章 刚地弓形虫实时荧光PCR检测及临床意义 438
一、刚地弓形虫的特点 438
二、刚地弓形虫的实时荧光PCR检测 439
三、刚地弓形虫PCR检测的临床意义 444
参考文献 444
第30章 解脲支原体实时荧光PCR检测及临床意义 446
一、解脲支原体的特点 446
二、解脲支原体实时荧光PCR检测 446
三、解脲支原体PCR检测的临床意义 451
参考文献 452
第31章 EGFR基因实时荧光PCR检测及临床意义 453
一、EGFR基因特点及常见突变类型 453
二、相关靶向治疗药物 454
三、EGFR基因突变实时荧光PCR测定及其临床意义 455
参考文献 463
第32章 KRAS基因实时荧光PCR检测及临床意义 466
一、KRAS基因特点及常见突变类型 466
二、KRAS基因突变实时荧光PCR测定及其临床意义 466
参考文献 477
第33章 BRAF基因突变的实时荧光PCR检测及临床意义 479
一、BRAF的基因组结构特点 479
二、BRAF基因突变实时荧光PCR测定及其临床意义 480
参考文献 484
第34章 PIK3CA基因突变实时荧光PCR检测及临床意义 486
一、PIK3CA的基因结构特点 486
二、PIK3CA基因突变实时荧光PCR测定及其临床意义 487
参考文献 497