第一篇 通过感染模型研究细菌的毒力 3
第一章 用大蜡螟作为感染模型进行筛选 3
1 前言 4
2 材料 5
2.1 细菌菌株和昆虫 5
2.2 注射装置和设备 5
2.3 细菌生长和溶液的配制 5
3 研究方法 6
3.1 细菌准备 6
3.2 大蜡螟的准备和感染 6
注释 7
参考文献 8
第二章 肠道感染的动物模型——果蝇 9
1 前言 10
2 材料 13
2.1 果蝇的培养 13
2.2 果蝇的品系和处理 13
2.3 细菌培养 14
2.4 经口感染和生存分析 14
2.5 血淋巴中的细菌计数 15
2.6 吞噬作用的阻滞 15
2.7 肠道解剖 15
2.8 肠道固定 15
2.9 肠道免疫染色 16
2.10 将解剖后的肠道置于显微镜载玻片上，并进行成像和数据分析 16
2.11 SYTOX Green分析 16
2.12 Smurf试验 17
2.13 RNA提取 17
2.14 蛋白质提取 17
2.15 BONCAT方法监测整体的蛋白翻译 18
2.16 监测copper细胞区域的酸化 18
3 方法 18
3.1 经口感染 18
3.2 生存分析 19
3.3 果蝇体内全部的菌量 19
3.4 血淋巴中的细菌计数 19
3.5 肠上皮内的细菌数 20
3.6 吞噬作用的阻滞 20
3.7 肠道解剖 20
3.8 肠道的封闭和免疫染色 21
3.9 肠道组织涂片 21
3.10 SYTOX Green方法检测上皮的完整性 22
3.11 Smurf试验检测消化道的完整性 22
3.12 从成年果蝇的中肠提取RNA 22
3.13 从解剖的肠道中提取蛋白质 23
3.14 通过BONCAT方法监测蛋白质的合成 23
3.15 监测果蝇中肠泌酸区域的生理功能 23
注释 24
致谢 28
参考文献 28
第三章 斑马鱼胚胎作为动物模型研究细菌毒力 32
1 前言 33
1.1 显微注射 34
2 材料 34
2.1 取卵并准备注射 34
2.2 细菌培养和培养液的准备 35
2.3 显微注射 35
2.4 细菌增殖的分析 35
2.5 生存分析和活体成像的工具 36
2.6 qRT-PCR和RNA-Seq分析 36
3 方法 36
3.1 获取鱼卵并准备感染实验的胚胎 36
3.2 培养洋葱伯克氏菌用于感染及接种液的准备 37
3.3 显微注射 37
3.4 胚胎生存研究 38
3.5 测定细菌增殖解读细菌的毒力 38
3.6 在感染期的实时观测 39
3.7 提取RNA用于qRT-PCR和RNA序列的分析 39
3.8 qRT-PCR的分析 39
注释 40
致谢 47
参考文献 47
第四章 研究小鼠活体内宿主和病原的相互作用并通过实时生物光子成像进行可视化观察 50
1 前言 51
1.1 生物荧光标记病原菌的可视化 51
1.2 用急性毒性布鲁氏菌感染小鼠模型 51
1.3 慢性毒力布鲁氏菌感染小鼠模型 52
1.4 用突变型布鲁氏菌感染小鼠模型 52
1.5 评价候选的疫苗 53
1.6 宿主糖、赤藓糖醇及布鲁氏菌感染的作用 53
2 材料 54
2.1 羊布鲁氏菌 54
2.2 抗生素 54
2.3 质粒和转座子的准备 54
2.4 用于老鼠安乐死的设备 55
2.5 用于羊布鲁氏菌电穿孔的设备和培养基 55
2.6 老鼠模型和感染 55
2.7 CCD成像 55
2.8 赤藓糖醇运输实验 56
3 方法 56
3.1 构建发生物荧光的布鲁氏菌 56
3.2 感染老鼠 57
3.3 生物发光成像技术监测老鼠的感染状况 57
3.4 组织的离体成像 57
3.5 赤藓糖醇运输实验 57
注释 58
致谢 60
参考文献 60
第五章 基于活体双光子成像技术的哺乳动物细菌感染研究 63
1 前言 64
2 材料 66
2.1 细菌及培养条件 66
2.2 荧光团——共轭右旋糖酐 66
2.3 通过显微注射诱导感染 66
3 方法 67
3.1 术前准备及细菌的培养 67
3.2 实验动物的术前准备 68
3.3 大鼠的外科手术以及细菌浸液（输液） 68
3.4 成像过程 69
3.5 后成像过程 70
注释 70
致谢 72
参考文献 72
第二篇 宿主与细菌在细胞层面的相互作用 77
第六章 Cre报告基因分析易位（CRAfT）：一种用于研究宿主细胞内蛋白转运的工具 77
1 前言 78
2 材料 79
2.1 细菌菌株、Cre质粒构建、转基因报告宿主 79
2.2 农杆菌属培养基储液 79
2.3 农杆菌的生长 80
2.4 平板培养基的储备液 80
2.5 植物培养和根基的转换 81
2.6 用于酵母培养基的储备溶液 82
2.7 酵母生长和转换 82
3 方法 83
3.1 植物测定 83
3.2 酵母测评 84
注释 85
参考文献 89
第七章 宿主与细菌蛋白间相互关系的检测：真核核仁蛋白与弗朗西斯菌属延长因子Tu的相互作用 92
1 前言 93
2 材料 93
2.1 用土拉热杆菌感染人体细胞 93
2.2 LVS亚细胞分离的准备 94
2.3 免疫印迹法 94
2.4 荧光实验 95
2.5 抗体和多肽 95
2.6 琼脂糖珠 95
3 方法 96
3.1 核仁蛋白肽可降低LVS与人类细胞的相互作用 96
3.2 核仁蛋白肽可降低LVS对人类细胞的感染 96
3.3 Anti-EF-Tu抗体降低LVS与人类细胞上的相互作用 97
3.4 Anti-EF-Tu可以降低LVS对人类细胞的感染 97
3.5 用生物素一亲和素珠进行pull down试验 98
3.6 用GST琼脂糖珠进行Pull-down试验 99
3.7 共聚焦显微镜 99
注释 100
参考文献 101
第八章 劫持宿主蛋白酶体以时序性降解细菌效应蛋白 104
1 前言 105
1.1 背景 105
1.2 方法概述 106
2 材料 107
2.1 体外泛素连接酶试验 107
2.2 分离被军团杆菌感染的细胞并用于检测泛素化效应蛋白 108
2.3 在军团菌感染细胞中检测泛素化蛋白的降解。 108
3 方法 109
3.1 泛素连接酶的体内测定 109
3.2 分离被军团杆菌感染的细胞以检测泛素化的效应蛋白 109
3.3 军团菌感染细胞内的泛素化蛋白降解检测 110
注释 111
致谢 112
参考文献 112
第九章 军团杆菌感染期磷酸肌醇动力学活细胞成像 114
1 前言 115
1.1 嗜肺军团杆菌破坏磷脂酰肌醇脂质 115
1.2 阿米巴盘基网柄菌做为一种军团杆菌的感染模型 116
1.3 LCV PI模型的活细胞成像分析 116
2 材料 117
2.1 嗜肺军团菌 117
2.2 盘基网柄菌 118
2.3 显微镜检查 118
3 方法 119
3.1 用于感染的嗜肺军团菌的培养 119
3.2 盘基网柄菌培养 119
3.3 转化盘基网柄菌用来表达荧光探针 119
3.4 接种盘基网柄菌用于感染和显微观察 120
3.5 快速感染过程中的实时成像 120
3.6 动态感染过程中的实时观察 121
注释 121
致谢 123
参考文献 123
第十章 细菌蛋白干扰细胞凋亡的研究 126
1 前言 127
2 材料 127
2.1 培养物 127
2.2 培养基和材料 128
2.3 免疫标记 129
2.4 质粒 129
2.5 其他试剂及设备 129
3 方法 131
3.1 被感染细胞的免疫标记 131
3.2 转染 132
3.3 诱导细胞凋亡 132
3.4 诱导凋亡细胞的免疫染色 133
3.5 PARP裂解分析 133
3.6 转化酵母细胞中Ats-1的定位 134
3.7 Ats-1使酵母细胞避免由Bax诱导引起的生长停滞 135
3.8 Bax转化至酵母线粒体的过程分析 135
注释 137
参考文献 138
第十一章 基于双分子荧光互补技术研究植物宿主内的微生物病原体蛋白质互作成像 140
1 前言 141
2 材料 142
3 方法 147
3.1 使用pSAT－衍生的植物BiFC载体进行克隆 147
3.2 制备烟草BY-2原生质体 148
3.3 PEG介导BY-2原生质体的转染 148
3.4 获得荧光图像 149
3.5 先进的BiFC技术和问题排除 149
注释 149
致谢 154
参考文献 154
第十二章 细菌感染小鼠树突状细胞的TLR信号应答研究 157
1 前言 158
2 材料 159
2.1 准备BMDCs 159
2.2 BMDCs感染 160
2.3 树突状细胞的活化和TLR应答分析 160
3 方法 162
3.1 BMDCs准备 162
3.2 细菌感染骨髓树突状细胞 163
3.3 树突状细胞活化和Toll样受体免疫应答分析 163
注释 165
参考文献 168
第三篇 组学与大规模筛查 173
第十三章 利用果蝇细胞siRNA筛选鉴定宿主感染所需的因素 173
1 前言 174
2 材料 175
2.1 菌株和细胞 175
2.2 培养基和抗生素 175
2.3 抗体／染料／试剂 176
2.4 显微镜 176
2.5 药物 176
2.6 溶液和试剂 177
2.7 设备 177
3 方法 177
3.1 细菌培养 177
3.2 细胞培养 177
3.3 布鲁氏菌感染，药物治疗及庆大霉素保护实验 178
3.4 感染宿主S2细胞的活力分析 178
3.5 对亚细胞标记的感染果蝇S2细胞进行表达分析 179
3.6 免疫荧光显微镜分析 179
3.7 药物治疗 179
3.8 dsRNAs的生成 180
3.9 RNAi介导的基因敲除与分析 180
3.10 小鼠胚胎成纤维细胞感染 181
3.11 统计分析 181
注释 181
参考文献 184
第十四章 胞内细菌的纯化：从宿主细胞中分离有活性的流产布鲁氏菌 186
1 前言 187
2 材料 187
2.1 细胞培养和感染 188
2.2 胞内细菌的纯化 188
2.3 细菌的免疫检测 189
2.4 免疫印迹分析 190
2.5 RNA转录的检测 190
3 方法 191
3.1 细胞培养和细菌接种准备 191
3.2 感染 191
3.3 胞内细菌的提取和纯化 192
3.4 纯化细菌的免疫检测 192
3.5 纯化细菌的免疫印迹分析 193
3.6 检测纯化细菌的RNA转录 193
注释 194
致谢 196
参考文献 196
第十五章 对斑马鱼感染模型流式细胞分选（FACS-Sorted）免疫细胞群RNA测序以识别细胞对细胞内病原体的特异性反应 198
1 前言 199
2 材料 200
2.1 细胞分离和FACS分选组成 200
2.2 RNA提取和文库制备 200
3 方法 201
3.1 细胞分离和FACS分选 201
3.2 RNA提取，文库制备和RNA测序 201
3.3 数据分析和质量评估 202
注释 203
致谢 205
参考文献 205
第十六章 细菌高通量鸟枪蛋白质组学分析的捷径 209
1 前言 210
2 材料 210
2.1 获得细菌培养物 210
2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 211
2.3 蛋白质的还原，烷基化和消化 211
2.4 nanoLC-MS/MS 212
2.5 鉴定 212
2.6 定量 212
3 方法 212
3.1 获得细菌培养物 212
3.2 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 212
3.3 蛋白质还原，烷基化和消化 213
3.4 nanoLC-MS/MS 213
3.5 鉴定 214
3.6 定量 214
注释 214
致谢 216
参考文献 216
第十七章 PATRIC生物信息学资源中心的比较基因组分析 218
1 前言 219
2 材料 220
3 方法 221
3.1 搜索目的基因 221
3.2 搜索目的基因组并进行组别归纳以进行比较分析 222
3.3 比较基因组学：利用蛋白质家族分类检查Pan蛋白质组 224
3.4 比较代谢组学：检查多个基因组的代谢途径 227
致谢 229
参考文献 229
第四篇 难治性细菌的研究方法 233
第十八章 洋葱伯克霍尔德菌及其他多重耐药革兰氏阴性菌的基因无标记敲除方法 233
1 前言 234
2 材料 235
2.1 生长培养基、抗生素、化学试剂 235
2.2 细菌菌株 235
2.3 核酸序列 236
2.4 DNA载体 236
2.5 引物 236
2.6 分子克隆所涉及的酶，试剂盒和材料 237
3 方法 238
3.1 缺失质粒的构建（pDeIatsR） 238
3.2 缺失质粒结合导入伯克霍尔德菌 239
3.4 互补质粒结合导入伯克霍尔德菌 241
注释 241
致谢 243
参考文献 243
第十九章 在贝氏柯克斯体中的基因失活 246
1 前言 247
2 材料 248
2.1 自杀质粒的构建 248
2.2 贝氏柯克斯体的转化与缺失突变体的筛选 248
2.3 贝氏柯克斯体基因敲除分析 249
3 方法 249
3.1 特异性基因自杀质粒的构建 249
3.2 贝氏柯克斯体的转化 251
3.3 通过PCR鉴定初级整合子 251
3.4 基因缺失菌株的蔗糖筛选 252
3.5 通过PCR鉴定基因缺失 252
3.6 缺失突变体的克隆 252
3.7 GOI缺失的验证 253
注释 253
致谢 255
参考文献 255
第二十章 鉴定细胞内病原沙眼衣原体毒力因子的一种化学诱变方法 257
1 前言 258
2 材料 258
2.1 细菌和细胞培养 258
2.2 化学诱变 259
2.3 菌斑纯化 259
2.4 全基因组测序 259
2.5 设备 260
3 方法 260
3.1 化学诱变 260
3.2 通过菌斑克隆纯化分离衣原体突变株 260
3.3 全基因组测序筛选衣原体突变株 261
3.4 产生衣原体重组子 262
注释 263
参考文献 264
附图 267