1 哺乳动物细胞转录调控入门 1
引言和概述 1
全基因组方法小结 3
染色质和通用转录机器 5
染色质结构和组织 5
染色质修饰 8
染色质重塑 12
通用转录机器 17
调控区的组织 18
基础转录复合物的组装和起始 25
调解因子 28
TFIID和TAF 29
活化和抑制 31
基因活化 31
转录起始期间的染色质修饰和重塑 32
通用机器募集的一种模式 34
聚合酶Ⅱ延伸的初始阶段 35
聚合酶Ⅱ在基因内遭遇核小体 37
转录的沉默或抑制 39
结语 45
参考文献 46
2 初始策略性问题 55
引言和概述 55
实验策略 56
新转录因子的表征方法 56
分析新基因的调控 60
专题2.1核连缀转录分析 63
考虑达到明确目标所需的时间投入和资源 64
确定项目目标 65
评估分析的可行性 66
启动对新基因的综合转录调控分析 68
技术 70
方案2.1核连缀分析 70
参考文献 77
3 转录起始位点的定位 79
引言和概述 79
实验策略 82
初步考虑 82
快速扩增cDNA末端（RACE） 84
专题3.1帽子依赖性RACE程序 85
引物延伸 87
专题3.2引物延伸 87
RNase保护法 91
专题3.3 RNase保护 92
S1核酸酶分析 94
专题3.4核酸酶保护 95
专题3.5内含子对起始位点定位结果解释的影响 96
技术 98
方案3.1引物延伸分析 98
方案3.2RNase保护分析 106
参考文献 113
4 启动子分析的功能性分析方法 116
引言和概述 116
实验策略 119
选择分析方法：各种分析方法的优缺点 119
瞬时转染分析 127
专题4.1常用的转染方法 128
专题4.2萤光素酶报告基因分析 130
专题4.3 CAT报告基因分析 131
专题4.4 LacZ、SEAP和GFP报告基因分析法 133
专题4.5瞬时转染细胞的分离 134
通过染色体整合的稳定转染分析 139
专题4.6有复制能力的载体 141
技术 147
哺乳动物细胞的常用转染方法 147
方案4.1 3T3成纤维细胞的磷酸钙转染 148
方案4.2淋巴细胞系的DEAE-葡聚糖转染 150
方案4.3 RAW264.7巨噬细胞的电穿孔转染 152
方案4.1～4.3的附加说明 155
方案4.4萤光素酶分析 156
方案4.5氯霉素乙酰转移酶分析 158
方案4.6 β-半乳糖苷酶分析 161
参考文献 163
5 远程控制区的鉴定和分析 169
引言和概述 169
专题5.1 DNase I高敏感性分析 173
实验策略 176
DNase I高敏感性 176
基质附着区的鉴定 180
专题5.2鉴定MAR的方法 180
鉴定远程控制区的功能性方法 182
表征远程控制区的功能性分析方法 187
参考文献 191
6 鉴定控制区内的顺式作用DNA元件 197
引言和概述 197
实验策略 199
通过综合性突变体分析鉴定控制元件 199
综合性分析的策略 200
来自综合性突变体分析与系统发生分析比较的深刻见解 213
参考文献 215
7 鉴定DNA结合蛋白及其基因 217
引言和概述 217
鉴定DNA结合蛋白的实验策略 219
数据库方法 219
用于粗制细胞裂解物的蛋白质-DNA相互作用分析方法的发展 222
专题7.1假设EMSA结果 229
克隆和鉴定编码DNA结合蛋白基因的实验策略 236
专题7.2通过蛋白质纯化克隆 237
通过蛋白质纯化和肽序列分析进行克隆 239
其他克隆方法 242
参考文献 246
8 确认蛋白质-DNA相互作用的功能相关性 249
引言和概述 249
实验策略 252
染色质免疫沉淀 252
通过基因破坏或RNA干扰的功能缺失研究 254
体外蛋白质-DNA复合物的丰度 257
DNA结合蛋白和靶基因的相对表达模式 258
蛋白质结合所需核苷酸和调控元件活性所需核苷酸之间的相关性 260
DNA结合蛋白的过量表达对报告基因或内源基因的反式激活 261
与相邻控制元件结合的蛋白质间的协作结合和协同效应 262
基因组足迹模式和体外足迹模式的比较 264
蛋白质-DNA相互作用的相对亲和力 265
显性失活突变体 267
体外转录策略 270
改变特异性实验 272
参考文献 274
9 内源性控制区的体内分析 279
引言和概述 280
实验策略 281
染色质免疫沉淀 281
DamID 283
DNase I和DMS基因组足迹 285
专题9.1连接介导PCR 286
高锰酸钾基因组足迹 289
核小体存在和定位的Southern印迹分析 289
专题9. 2通过MNase-Southern印迹分析进行核小体定位的低分辨率分析 291
监测核小体存在和定位的LM-PCR、PCR及ChIP策略 292
用于分析核小体重塑的体内方法的概述 295
DNase I高敏感性监测核小体重塑 295
用于监测核小体重塑的MNase方法 296
限制性内切核酸酶可及性分析 297
专题9.3限制性内切核酸酶可及性-LM-PCR分析 300
染色质构象捕获 303
DNA甲基化 305
技术 306
方案9.1 MNase-Southern印迹分析 306
方案9.2 LM-PCR方法 316
方案9.3染色质免疫沉淀 333
参考文献 340
10 鉴定和表征转录调控因子的结构域 348
引言和概述 349
实验策略：定义结构域 349
功能结构域的鉴定 349
专题10.1结构域的计算分析 350
基本突变原理 352
专题10.2表达系统 352
专题10.3标签识别与检测的通用方法 355
序列特异性调控因子的结构域 359
分离序列特异性调控因子的DNA结合和激活／抑制结构域 360
专题10.4 VP16激活结构域：个案研究 363
专题10.5 GAL4：个案研究 364
专题10.6 KRAB抑制结构域：个案研究 366
细分DNA识别亚结构域和寡聚化亚结构域 369
概念和策略：蛋白质-蛋白质相互作用 370
共激活因子和共抑制因子的分离及克隆 370
研究激活结构域与共激活因子相互作用的方法 371
通过亲和层析研究激活／抑制结构域与其靶标之间的相互作用 372
改变特异性遗传系统 374
通用转录机器的结构-功能分析 377
共激活因子的分析 379
技术 383
方案10.1 PCR介导的定点突变 383
参考文献 389
11 DNA的调控性转录因子结合 398
引言和概述 398
实验策略 401
DNA-蛋白质相互作用的一般理论和实例 401
专题11.1 Kd情况的例子 413
DNA-蛋白质相互作用的分析及建模 415
专题11.2 SAAB分析 418
专题11.3 DNase I足迹和外切核酸酶足迹 420
专题11.4用于小沟相互作用的化学探针 423
启动子特异性多组分核蛋白复合物的分析 432
技术 439
方案11.1 DNase I足迹 439
方案11.2羟自由基足迹 448
方案11.3磷酸乙基化干扰分析 452
方案11.4甲基化干扰分析 455
方案11.5电泳迁移率变动分析 461
方案11.6 32P末端标记DNA片段的准备 465
参考文献 470
12 体外转录和起始前复合物组装 477
引言和概述 478
实验策略 481
提取物的制备 481
转录分析 484
专题12.1测定体外转录的方法 485
分级分离的系统 490
专题12.2纯化的转录因子 493
基本起始前复合物的形成 496
开放复合物的形成、起始和启动子逃脱 508
活化复合物在启动子上的组装 513
技术 521
核提取物制备：概述 521
方案12.1 Dignam和Roeder核提取物 522
方案12.2使用HeLa细胞提取物和引物延伸的体外转录 526
方案12.3使用HeLa细胞核提取物的无G序列盒体外转录 533
共激活因子的纯化（方案12.4和方案12.5） 537
方案12.4表位标记TFIID的纯化 537
方案12.5从表达FLAG标记调解因子亚基的HeLa细胞系中纯化调解因子 543
方案12.6固定化模板分析 547
方案12.7 Pol II开放复合物的高锰酸钾探测 556
方案12.8 DNA结合TFIID的镁-琼脂糖EMSA 561
参考文献 566
13 体外研究染色质动力学：染色质组装、重塑和转录 588
引言和概述 588
实验策略 589
用于组装染色质的策略 589
专题13.1DNA模板和重建方法对阵列内核小体定位的影响 592
组蛋白来源 595
染色质重建的生化表征 598
专题13.2核小体阵列的MNase分析 603
专题13.3核小体阵列的EcoRI酶切分析 605
体外测验组蛋白修饰作用策略 606
染色质重塑／修饰酶的分析 610
以染色质模板进行体外转录 619
技术 621
方案13.1鸡红细胞组蛋白八聚体制备 621
方案13.2核小体的盐梯度透析重建 632
方案13.3利用重组的果蝇ACF和NAP1重建核小体阵列 637
参考文献 650
附录：注意事项 659
索引 668