第一部分 MicroRNA及其靶标的鉴定 1
1.病毒microRNA的鉴定 3
1.引言 3
2.病毒microRNA候选分子的计算机预测 7
2.1计算机鉴定microRNA的原理 7
2.2运用VMir预测病毒microRNA候选分子 9
3.病毒microRNA候选分子的芯片验证 11
3.1芯片的设计 13
3.2芯片的杂交 15
3.2.1小RNA的胶纯化 16
3.2.2标记和芯片的杂交 18
3.3数据分析 19
4.结束语 21
参考文献 22
2.应用鲁棒性机器学习算法预测microRNA基因及其靶标 25
1.引言 26
2.正确的使用机器语言 27
2.1数据集 28
2.2性能估算 28
2.3性能测量 30
2.4机器学习步骤 31
3.一种确定性和一种随机性的算法 33
3.1支持向量机 33
3.2Boosted遗传规划 35
4.使用支持向量机预测microRNA基因 37
4.1决定输入 38
4.2收集训练集 39
4.3MicroRNA基因预测软件的训练及其性能估计 39
4.4评估microRNA基因预测软件的性能 42
5.使用强化遗传算法预测microRNA靶标 43
5.1决定输入 43
5.2装配训练集 44
5.3训练和评估microRNA靶基因预测软件 44
5.4评估microRNA靶基因预测软件 45
6.小结 46
致谢 46
参考文献 46
3.病毒编码microRNA的鉴定 51
1.引言 52
2.Rn12（1-249）和腺苷酸化的3′接头寡核苷酸的纯化 55
3.小RNA片段的分离 55
4.纯化小RNA与腺苷酸化3′接头的连接 56
5.小RNA-3′接头与5′接头的连接 56
6.连接产物的逆转录反应 57
7.cDNA的首次PCR扩增 57
8.PmeⅠ酶切PCR产物 58
9.二次PCR扩增 58
10.BanⅠ酶切二次PCR产物 59
11.BanⅠ酶切DNA的串联连接 59
12.串联体的末端加尾与克隆入T／A载体 59
13.文库的测序及注释 60
14.结束语 60
参考文献 61
4.MicroRNA靶标预测的计算机方法 65
1.引言 66
2.microRNA靶标识别的原理 69
3.microRNA靶标基因分析的数据源 73
4.microRNA靶标预测的计算机软件 74
5.microRNA靶标基因预测的原始策略 79
6.计算机预测的验证 81
7.结束语 82
致谢 83
参考文献 83
第二部 MicroRNA的表达、成熟与功能分析 87
5.Dorsha复合体活性的体外和体内检测 89
1.引言 89
2.实验方法 94
2.1体外分析pri-miRNA的加工 94
2.1.1制备放射性标记的pri-miRNA转录本 94
2.1.2制备microprocessor 96
2.1.3Pri-microRNA加工的体外实验分析 97
2.2体内分析pri-miRNA的加工 99
2.2.1果蝇的Drosha或DGCR8的缺失 100
2.2.2Pri-miRNA的RT-PCR分析 100
2.2.3Northern杂交分析microRNA 101
致谢 105
参考文献 105
6.MicroRNA基因表达的基因芯片分析 107
1.引言 107
2.microRNA生物合成与作用方式的概述 109
3.microRNA表达的分析策略 110
4.microRNA基因芯片分析的注意事项 111
5.数据分析与说明 112
6.验证策略 113
7.microRNA基因芯片实验方案 113
7.1芯片点阵 113
7.2RNA提取 114
7.3标记和清洗 114
7.4杂交 115
8.数据分析 118
致谢 119
参考文献 119
7.哺乳动物细胞microRNA的克隆与表达检测 123
1.引言 124
2.microRNA的克隆 126
2.1总RNA提取 126
2.2运用flashPAGETM分离体系分离小RNA 128
2.3小RNA的多聚腺苷酸化 129
2.4多聚腺苷化小RNA的5′末端接头连接 130
2.5反转录 130
2.6PCR扩增第一条cDNA链 131
2.7聚丙烯酰胺凝胶纯化扩增的cDNA 131
2.8PCR产物克隆到TOPO-TA载体 133
3.microRNA的鉴定 133
4.Northern杂交验证microRNA的体内表达 134
致谢 136
参考文献 136
8.体外与体内研究microRNA和小干扰RNA甲基化的方法 139
1.引言 140
2.重组HEN1蛋白的表达与纯化 141
2.1构建表达载体 141
2.2带GST标签的hen1蛋白的表达和纯化 142
2.3带His标签的hen1蛋白的表达和制备 143
3.利用重组HEN1蛋白对小RNA甲基转移酶的检测 144
3.1通过监测掺入的［14碳］-甲基基团进行甲基转移酶分析 144
3.2通过监测掺入的［3氢］-甲基基团进行甲基转移酶分析 145
3.3通过监测β-消除进行甲基转移酶分析 147
4.应用逆相HPLC确定HEN1-催化反应产物中甲基基团的位置 148
5.免疫沉淀与HEN1活力检测 149
5.135S：：HA-HEN1的构建和植物转化 149
5.2HA-HEN1免疫沉淀和酶活性分析 149
6.microRNA和siRNA体内甲基化状态的分析 151
7.结束语 152
致谢 152
参考文献 153
9.发育过程中小RNA表达谱的分析 155
1.引言 156
2.低分子量RNA的制备与尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Urea-PAGE） 158
2.1原理 158
2.2方法 158
2.3材料 159
2.4备注 160
3.小RNA的克隆 161
3.1原理 161
3.2方法 161
3.3材料 162
3.4备注 163
4.小RNA的分类 163
4.1方法 163
5.Northern杂交分析 165
5.1原理 165
5.2方法 166
5.3材料 167
5.4备注 167
参考文献 167
10.T细胞发育过程中microRNA介导的基因调控与功能 171
1.引言 172
2.T细胞发育过程中microRNA表达特征的分析 172
2.1MicroRNA克隆分析 174
2.2MicroRNA定量PCR分析 175
3.构建表达microRNA的逆转录病毒载体 178
4.T细胞发育过程中microRNA的功能研究 180
5.功能相关microRNA靶标基因的鉴定和验证 183
6.材料与试剂 187
致谢 188
参考文献 188
第三部分 MicroRNA与疾病 191
11.白血病与淋巴瘤microRNA表达异常的研究 193
1.各种人类癌症的起始和发展都涉及microRNA表达的改变 194
2.基因组范围microRNA表达谱的基因芯片检测 195
2.1样品收集 200
2.2总RNA分离 200
2.3MicroRNA芯片的生产和描述 201
2.4靶标准备 202
2.5芯片杂交 202
2.6原始数据分析 203
2.7验证microRNA的结果 204
3.差异表达microRNA靶标的鉴定和验证 205
3.1构建有重要生物学意义的可能性靶标的数据库 206
3.2序列互补性研究 207
3.3荧光素酶活性报告分析 208
3.4相关病例中microRNA与mRNA靶标表达的相关性 208
3.5在体内鉴定差异表达microRNA的作用 209
致谢 210
参考文献 210
12.植物中受病原调控的小RNA的发现 215
1.引言 216
2.基于测序方法发现受病原调控的小RNA 217
3.基于杂交方法鉴定和验证受病原诱导的小RNA 219
3.1病原体感染组织的小RNA提取 219
3.1.GITC法提取总RNA 220
3.2小分子RNA的电泳和凝胶转移 221
3.3小RNA的杂交和检测 222
3.3.1使用末端标记的寡核苷酸探针检测小RNA 222
3.3.2使用一种核糖核酸探针检测小RNA 224
4.结束语 225
参考文献 226
13.病毒microRNA表达与功能分析的实验方案 229
1.引言 230
2.microRNA的表达框 232
3.稳定导入的载体系统 233
4.实验步骤：利用pNL-SIN-CMV-BLR microRNA表达载体构建表达microRNA的细胞系 235
5.根据报告基因确定microRNA的活性 237
6.实验步骤：病毒混合物制备与报告基因检测 237
7.结束语 240
致谢 240
参考文献 240
作者索引 245
主题索引 257