第一章 绪论 1
第一节 基因与基因工程的概念 1
一、基因 1
二、人类基因组计划 5
三、基因工程的概念 6
第二节 基因工程发展史 7
第三节 基因工程的巨大意义 8
第四节 生物技术与基因工程 10
第五节 中国基因工程的现状与前景 10
第六节 基因工程的安全性问题 13
第七节 我国的《基因工程安全管理办法》 15
第八节 基因工程的基本过程 16
第九节 基因工程上游和下游 16
第十节 基因工程的上游工程——基因克隆 17
第十一节 基因工程的流程 17
复习思考题 18
第二章 各种工具酶 19
第一节 基因工程工具酶的概念 19
第二节 限制性内切核酸酶 20
一、寄主细胞控制的限制与修饰 20
二、限制性核酸内切酶的种类 21
三、影响限制性内切酶活性的因素 24
四、限制性内切酶命名法 24
五、限制性内切酶的作用特点与应用 25
六、DNA的限制酶分析及物理图谱 25
第三节 DNA聚合酶 27
一、大肠杆菌DNA聚合酶 28
二、DNA聚合酶I大片段 30
三、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ 31
四、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ 31
五、T4-DNA聚合酶 32
六、T7噬菌体DNA聚合酶及测序酶 33
七、耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶） 33
八、末端转移酶 35
九、反转录酶 35
十、真核生物的DNA聚合酶 37
第四节 DNA连接酶 37
一、DNA连接酶的一般性质 37
二、DNA连接酶的作用机制 38
三、真核生物的DNA连接酶 40
第五节 S1核酸酶 40
第六节 Ba/31核酸酶 41
第七节 碱性磷酸酶 41
第八节 T4多聚核苷酸激酶 42
复习思考题 42
第三章 基因载体的选择与构建 43
第一节 基因载体、报告基因与载体的致死效应 43
一、基因载体的概念 43
二、载体的报告基因（标记基因） 44
三、载体的致死效应 44
第二节 细菌质粒载体 45
一、质粒的概念 45
二、质粒的复制和遗传 46
三、质粒的种类 46
四、质粒的相容性 47
五、质粒的报告基因 48
六、质粒的改造 49
七、质粒载体的多克隆位点 50
八、质粒DNA的提取 50
九、常用的质粒载体 52
十、质粒的用途与发展的质粒克隆载体 56
第三节 噬菌体载体 60
一、噬菌体和噬菌体载体 60
二、λ噬菌体的生物学 60
三、野生型λ噬菌体的改造 64
四、λ噬菌体的包装与克隆 65
五、单链噬菌体载体和噬菌粒 68
六、黏性质粒载体 70
第四节 酵母细胞克隆载体与酵母人工染色体 72
一、酵母附加体型质粒（YEps） 73
二、酵母整合型质粒（YIps） 74
三、酵母复制型质粒（YRps）与酵母着丝粒质粒（Ycps） 75
四、酵母人工染色体（YAC） 75
五、细菌人工染色体（BAC）和噬菌体人工染色体（PAC） 77
六、穿梭质粒 79
第五节 动物病毒载体 81
一、动物病毒载体的特点 81
二、杆状病毒载体 81
三、SV40载体 84
四、痘苗病毒载体 86
五、反转录病毒载体 86
六、其他动物病毒载体 88
第六节 植物病毒载体 88
复习思考题 89
第四章 目的基因的制取 91
第一节 目的基因制取的策略 91
一、外源基因与目的基因 91
二、目的基因制取的策略 91
第二节 鸟枪法制取目的基因 92
一、“鸟枪法”的概念 92
二、“鸟枪法”制取目的基因的特点 93
三、“鸟枪法”的主要步骤 94
四、枯草杆菌鸟枪法基因克隆 94
第三节 物理化学法分离目的基因 95
第四节 化学合成基因 95
一、聚核苷酸化学合成的历史 96
二、磷酸二酯法合成DNA 97
三、固相亚磷酰胺法 98
四、DNA合成在基因工程和分子生物学研究中的应用 100
第五节 反转录合成DNA 102
复习思考题 104
第五章 基因与载体的连接 105
第一节 基因重组克隆与亚克隆 105
第二节 基因重组对载体的要求与载体类型 106
一、克隆载体 106
二、表达载体 106
第三节 连接前的处理 107
第四节 黏性末端连接 108
一、单酶切位点的黏端连接 108
二、双酶切片段的定向克隆 111
三、不同限制酶切位点的黏端连接 112
第五节 平端连接 114
第六节 人工接头连接 116
第七节 同聚寡核苷酸末端连接 118
复习思考题 120
第六章 重组DNA导入受体细胞 121
第一节 克隆与导入方法 121
第二节 转化 122
一、大肠杆菌宿主菌 122
二、受体细菌的感受态 123
三、转化反应 123
四、枯草芽孢杆菌的转化反应 124
第三节 转染 125
一、磷酸钙沉淀法 125
二、体外包装转染法 126
第四节 共转化 126
第五节 电转化 127
第六节 基因枪法（微弹技术） 129
第七节 微注射技术 130
第八节 脂质体导入法 131
第九节 转化酵母菌 132
第十节 植物细胞的基因转移方法 133
第十一节 哺乳动物细胞基因导入法 133
第十二节 反转录病毒载体的转染 135
复习思考题 136
第七章 聚合酶链式反应 137
第一节 PCR技术基本原理 137
第二节 PCR反应体系与引物设计 141
一、PCR反应体系 141
二、设计PCR引物时的一般原则 143
第三节 PCR一般循环参数 144
第四节 影响PCR反应结果的因素 145
第五节 PCR技术用于基因克隆 146
一、目的基因的直接克隆 146
二、目的基因的cDNA的克隆 146
三、PCR技术用于基因克隆的其他方式 147
第六节 发展中的各种PCR应用技术 147
一、反转录PCR 147
二、反向PCR 149
三、复合PCR 150
四、定量PCR 153
五、不对称PCR 153
六、嵌套PCR 154
七、免疫PCR 154
八、长PCR 155
九、热启动PCR 155
十、标记PCR（彩色PCR） 155
十一、重组PCR 156
十二、差向显示PCR 156
十三、降落PCR 156
十四、兼并引物PCR 157
十五、原位PCR 157
十六、玻片PCR 158
十七、连接酶链反应（LCR） 158
十八、MSP甲基化特异PCR 160
第七节 各种PCR突变检测技术 160
第八节 关于PCR技术应用的小结 162
复习思考题 162
第八章 基因文库的构建 163
第一节 基因文库的概念与文库的类别 163
一、基因文库的概念 163
二、基因文库的类别 163
三、基因文库的大小 165
第二节 基因文库的构建 167
一、基因组文库的构建 167
二、cDNA文库的构建 171
第三节 利用PCR技术构建cDNA文库 176
第四节 全长cDNA文库的构建 178
一、cDNA文库的质量与全长cDNA 178
二、RACE构建cDNA文库 179
三、用oligo-capping法构建全长cDNA文库 181
四、SMART技术 183
第五节 差示文库与消减文库 186
一、mRNA差别显示 186
二、差别杂交法与差示文库 188
三、消减杂交法与消减文库 190
四、代表性差异显示（RDA） 192
五、抑制消减杂交 194
第六节 染色体或区域特异性cDNA文库 197
第七节 人工染色体文库 198
一、酵母人工染色体（YAC）文库 198
二、细菌人工染色体（BAC）文库 200
复习思考题 202
第九章 重组体的鉴定与文库筛选 203
第一节 重组体转化子的鉴定与文库筛选 203
第二节 遗传检测筛选法 204
一、根据载体表型特征的直接选择法 204
二、根据插入序列表型特征的直接选择法 205
第三节 物理检测法 205
一、凝胶电泳检测法 205
二、限制酶切分析法 208
三、异源双链杂交检测法与R-环检测法 208
第四节 核酸杂交法 209
一、以寡核苷酸探针筛选目的基因 209
二、原位杂交与寡核苷酸探针筛选文库 212
三、Southern印迹杂交 213
四、Northern印迹杂交 214
第五节 免疫化学检测法 214
一、各种标记的免疫化学检测法 215
二、以单克隆抗体探针筛选目的基因 216
三、表达载体产物免疫化学检测法 217
第六节 检测蛋白质筛选克隆基因 217
第七节 体外表达筛选技术（表达检测系统） 220
第八节 cDNA文库筛选的方法 223
第九节 cDNA文库的标准化 225
第十节 BAC文库鉴定和筛选 229
复习思考题 230
第十章 目的基因的表达 231
第一节 原核生物基因表达调控的生物学 231
一、原核细胞表达的特点 231
二、原核生物的转录调控 231
三、原核生物基因的转录后调控 233
第二节 真核生物基因表达的调控 234
一、DNA染色质结构的调控与顺反子的概念 234
二、转录调控 234
三、RNA对基因表达的调控 235
四、翻译过程的调控 235
第三节 基因工程中的基因表达 235
一、制约目的基因表达的因素 235
二、阅读框架 236
三、启动子及其保守序列的影响 236
四、终止子和衰减子的影响 237
五、翻译过程对表达的影响 238
第四节 融合基因与融合蛋白的表达 239
第五节 以大肠杆菌为代表的原核表达体系 240
一、大肠杆菌表达系统的特点 240
二、大肠杆菌表达融合蛋白 240
三、大肠杆菌细胞包涵体 241
四、提高克隆基因在大肠杆菌中表达效率的途径 242
第六节 表达型载体 243
第七节 真核表达体系的特点与外源基因在真核细胞表达 248
第八节 酵母表达体系 248
一、酿酒酵母中外源基因的表达 249
二、甲醇酵母中外源基因的表达 249
三、出芽酵母中外源基因的表达 249
四、常用的酵母转化方法 250
五、酵母表达外源基因的缺陷和改进方法 250
第九节 昆虫或昆虫细胞表达体系 251
第十节 哺乳动物细胞表达体系 254
第十一节 新型的胞浆表达体系 254
复习思考题 255
第十一章 转座子在基因工程中的应用 256
一、DNA的转座现象与转座子 256
二、质粒的转座子 259
三、转座作用的机制 259
四、转座的遗传学效应 260
五、控制转座与监测转座子 261
六、转座子基因标签法 261
七、标签的策略 264
八、标签基因的分离和克隆 265
九、转座子技术的发展与应用前景 268
复习思考题 269
第十二章 核苷酸序列测定 270
一、Sanger酶法（双脱氧链终止法） 270
二、Maxam-Gilbert DNA化学降解法 273
三、定向测序法 276
四、鸟枪法测序 278
五、人工转座子法 282
六、杂交测序技术 282
七、PCR测序 285
八、自动化测序法 286
九、几种正在发展的测序方法 287
十、DNA序列测定的策略与发展方向 291
复习思考题 292
第十三章 基因克隆的策略和技术 293
第一节 基因克隆方法的种类 293
第二节 经典文库克隆与特异抗体克隆技术 294
第三节 定位克隆策略 295
一、定位克隆的基本原理 295
二、定位克隆的三个主要步骤 297
三、定位克隆的主要操作过程 299
四、定位克隆的主要策略 303
五、大片段DNA克隆文库的载体 305
六、功能互作研究与定位克隆的应用与发展 305
第四节 表型克隆的策略 308
一、基因组错配筛选（GMS） 308
二、随机引物PCR 310
三、外显子扩增技术（exon-PCR） 311
四、表型克隆与定位克隆策略的比较 311
第五节 cDNA克隆策略 312
第六节 生物信息基因克隆技术 313
复习思考题 317
第十四章 基因打靶、反义技术与核酶技术 318
第一节 基因打靶技术 318
一、基因打靶的主要实验系统 318
二、基因打靶的主要步骤 319
三、筛选基因打靶命中的细胞株 320
四、基因打靶技术的策略与技术 321
五、大规模随机基因剔除——基因捕获 324
六、基因敲人法研制转基因小鼠 325
七、基因打靶技术的特点 326
八、基因打靶技术的应用 326
第二节 反义技术 327
一、反义链与反义寡核苷酸 327
二、反义技术的原理 329
三、人工设计反义RNA的策略 329
四、反义技术的特点 331
五、ASON的改造与反义药物 331
第三节 核酶技术 331
一、核酶的特性与作用 331
二、核酶的设计 332
三、核酶的克隆和应用 333
第四节 反义技术与核酶技术的应用 333
复习思考题 336
第十五章 蛋白质工程 337
第一节 蛋白质工程与基因工程 337
第二节 蛋白质结构分析、功能的设计与改造 338
一、蛋白质结构分析 338
二、蛋白质结构、功能的设计 338
三、蛋白质结构改造 338
第三节 蛋白质工程的一般流程 341
第四节 功能克隆策略——噬菌体展示技术 341
一、丝状噬菌体展示系统 342
二、T4噬菌体展示系统 343
三、λ噬菌体展示系统 344
四、噬菌体展示基本操作过程 347
五、抗体表面展示 351
第五节 细菌表面展示生物技术 352
一、革兰阴性菌表面展示 353
二、革兰阳性菌表面展示 353
第六节 酵母表面展示系统 354
第七节 其他体外展示技术 354
第八节 蛋白质工程的新策略——分子定向进化 355
一、易错PCR 355
二、DNA改组技术 355
三、交错延伸技术 357
四、体外随机引发重组 358
五、杂合酶技术 359
六、蛋白质分子定向进化技术的发展 359
第九节 蛋白质工程的应用与发展前景 360
复习思考题 361
第十六章 基因工程下游工程的分化 363
第一节 下游常用的分离、纯化、分析鉴定技术 363
一、DNA合成粗产物的提纯 363
二、蛋白质产品常用的分离提取技术 364
第二节 原核细胞表达系统与发酵工程 366
第三节 植物基因工程 366
第四节 昆虫或动物细胞表达系统 368
第五节 动物基因工程 368
第六节 基因工程与产业化 369
第七节 基因工程药物与疫苗 371
第八节 基因治疗 372
复习思考题 373
索引 374