1 基因工程概述 1
1.1 基因工程概念 1
1.1.1 基因工程的基本定义 1
1.1.2 基因工程的基本原理和流程 1
1.2 基因工程发展简史 3
1.2.1 早期准备 3
1.2.2 基因工程的诞生 3
1.2.3 基因工程的成熟 3
1.2.4 进入第二代基因工程 3
1.3 基因工程技术研究的主要内容 4
1.3.1 基因工程的基础性研究 4
1.3.2 基因工程的应用性研究 5
2 基因操作中的工具酶 7
2.1 限制性内切酶 7
2.1.1 限制性内切酶的识别序列 7
2.1.2 限制性内切酶的命名 8
2.1.3 限制性内切酶的酶切片断 8
2.1.4 限制性内切酶的类型 8
2.1.5 限制性内切酶的反应系统 9
2.2 DNA聚合酶 9
2.2.1 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 9
2.2.2 DNA聚合酶Ⅰ的大片段（Klenow片段） 10
2.2.3 T4噬菌体DNA聚合酶 10
2.2.4 T7噬菌体DNA聚合酶 11
2.2.5 热稳定的DNA聚合酶 11
2.2.6 逆转录酶 12
2.2.7 末端转移酶 12
2.3 DNA连接酶 13
2.3.1 T4 DNA连接酶 13
2.3.2 大肠杆菌的DNA连接酶 14
2.4 RNA聚合酶 14
2.5 其他工具酶类 15
2.5.1 碱性磷酸酶 15
2.5.2 T4多核苷酸激酶 15
2.5.3 核酸酶 15
3 基因工程载体 17
3.1 载体的基本要求和特性 17
3.1.1 载体的基本要求 17
3.1.2 载体具有与使用目的相一致的结构 18
3.2 质粒载体 18
3.2.1 质粒载体的生物学特性 18
3.2.2 质粒载体构建的思路 19
3.2.3 pBR322质粒载体 21
3.2.4 pUC质粒载体 21
3.2.5 pGEM系列载体质粒 23
3.2.6 pBluescriptⅡKS 24
3.3 λ噬菌体载体 24
3.3.1 λ噬菌体的生物学特性 24
3.3.2 λ噬菌体构建载体的依据 26
3.3.3 构建λ噬菌体载体的基本策略 26
3.3.4 λ噬菌体载体的举例 28
3.3.5 λ噬菌体载体的应用 32
3.4 M13噬菌体载体 32
3.4.1 M13噬菌体与载体有关生物学特性 32
3.4.2 构建M13载体 32
3.4.3 噬菌粒载体 33
3.4.4 M13载体的应用 34
3.5 cosmid载体 35
3.5.1 cosmid载体的概况 35
3.5.2 cosmid载体的特性 35
3.5.3 cosmid载体使用的基本程序 36
3.6 酵母人工染色体 36
3.7 细菌人工染色体 37
3.8 哺乳动物细胞的载体 38
3.8.1 SV40载体 39
3.8.2 腺病毒载体 40
3.8.3 痘苗病毒 41
3.8.4 逆转录病毒载体 41
4 核酸的分离纯化和制备 43
4.1 质粒DNA的制备 43
4.1.1 质粒DNA提取方法的选择 43
4.1.2 质粒提取的共同步骤 44
4.1.3 SDS碱裂解法小量制备质粒DNA 44
4.1.4 SDS碱裂解法大量制备质粒DNA 45
4.1.5 提取质粒DNA的其他方法 46
4.1.6 质粒纯化的氯化铯-溴化乙锭梯度平衡超离心法 46
4.1.7 DNA制备中几项常规操作 47
4.2 λ噬菌体DNA的制备 48
4.2.1 λ噬菌体颗粒的制备 48
4.2.2 λ噬菌体DNA的制备 48
4.3 真核基因组DNA的分离 49
4.3.1 制备高分子量DNA的方法 49
4.3.2 基因组DNA酶切片段化 49
4.4 用于cDNA克隆的mRNA分离纯化 50
4.4.1 细胞内mRNA丰度的差异 50
4.4.2 制备mRNA之前需要考虑的问题 50
4.4.3 真核细胞mRNA的提纯 51
4.4.4 mRNA的检测 52
4.4.5 mRNA的富集 52
4.5 基因的化学合成和片段设计 53
4.5.1 寡核苷酸化学合成的方法 53
4.5.2 核苷酸单体修饰基团和固相载体 54
4.5.3 寡聚核苷酸化学合成的基本步骤 55
4.5.4 DNA大片段合成的策略 56
4.5.5 DNA化学合成的应用 57
4.6 聚合酶链式反应 57
4.6.1 PCR反应的原理 57
4.6.2 PCR反应过程 57
4.6.3 PCR反应循环参数的设定 58
4.6.4 耐高温的DNA聚合酶 58
4.6.5 PCR的引物 59
4.6.6 PCR的应用 60
4.7 核酸的定量和检测 61
4.7.1 DNA或RNA的分光光度法测定 62
4.7.2 用Hoechst33258进行荧光测定 62
4.7.3 用溴化乙锭定量测定双链DNA 62
4.7.4 SYERGold染色 62
4.8 凝胶电泳技术 63
4.8.1 琼脂糖凝胶电泳的原理 63
4.8.2 琼脂糖凝胶电泳的影响因素 63
4.8.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 64
4.8.4 脉冲场凝胶电泳 64
5 DNA克隆 66
5.1 DNA克隆的策略和技术路线 66
5.1.1 DNA克隆的概念 66
5.1.2 DNA克隆的要素 66
5.1.3 DNA克隆的技术路线 67
5.2 目的基因的来源 68
5.3 DNA分子片段化 68
5.3.1 DNA分子经限制性内切酶酶切的末端结构 68
5.3.2 确定单一酶切或双酶酶切 69
5.3.3 DNA的部分酶切 69
5.3.4 影响DNA片段化的反应条件 69
5.3.5 DNA片段的回收 70
5.4 DNA片段的体外重组 71
5.4.1 DNA连接酶催化DNA的连接 71
5.4.2 同源粘性末端之间的连接 71
5.4.3 平头末端之间的连接 72
5.4.4 定向重组和定向克隆 72
5.4.5 DNA末端的修饰改造 73
5.5 重组DNA导入受体细胞 76
5.5.1 受体细胞 76
5.5.2 重组DNA导入原核生物细胞 77
5.5.3 重组λ噬菌体DNA转导大肠杆菌 78
5.5.4 重组DNA导入哺乳动物细胞 78
5.6 亚克隆技术 79
6 DNA序列测定 81
6.1 概述 81
6.1.1 DNA测序的发展 81
6.1.2 DNA测序的策略 82
6.2 双脱氧末端终止法 82
6.2.1 双脱氧末端终止法的原理 82
6.2.2 双脱氧末端终止法的要素 83
6.2.3 双脱氧末端终止法的试剂条件 84
6.2.4 DNA测序的放射性标记 85
6.2.5 双脱氧末端终止法测序的载体系统 85
6.2.6 T7 DNA聚合酶进行双脱氧测序反应 88
6.2.7 Taq酶进行双脱氧测序 90
6.2.8 PCR进行双脱氧测序 90
6.2.9 测序凝胶上分离DNA序列 90
6.3 大规模DNA测序 91
6.3.1 双脱氧末端终止法测定DNA序列方法的选择 91
6.3.2 大片段的随机重叠DNA文库 91
6.3.3 大片段测序的引物步移策略 93
6.3.4 待测DNA大片段定向连续次级克隆 94
6.4 DNA测序自动化和测序技术的发展 95
6.4.1 DNA测序技术的进展 95
6.4.2 基于凝胶电泳的两种测序系统 96
6.4.3 荧光标记的两种方式 96
6.4.4 其他测序方法 97
7 DNA文库 98
7.1 两类DNA文库 98
7.1.1 DNA文库的概念 98
7.1.2 基因组文库包含一种生物的全部遗传信息 99
7.1.3 cDNA文库反映了特定细胞的转录组 99
7.1.4 构建DNA文库的一般程序 100
7.2 构建cDNA文库的常用方法 100
7.2.1 polyA-mRNA逆转录合成单链cDNA 100
7.2.2 运用不同引物合成cDNA第二链 101
7.2.3 cDNA第二链的合成条件 104
7.2.4 DNA的人工接头或插口 104
7.2.5 cDNA克隆载体的比较 105
7.2.6 cDNA与人工接头或插口的连接 106
7.2.7 双链cDNA与λ噬菌体臂的连接和体外包装 107
7.2.8 cDNA文库的改进 107
7.3 基因组文库的概况 108
7.3.1 构建基因组文库的基本步骤 108
7.3.2 基因组文库的大小 108
7.4 λ噬菌体载体构建真核基因组DNA文库的 109
7.4.1 DNA片段的分离 109
7.4.2 λ载体臂的制备 109
7.4.3 基因组DNA片段与λ载体臂的连接 110
7.4.4 基因组文库的扩增 110
7.5 大容量载体构建基因组DNA文库 111
7.5.1 cosmid构建基因组文库的优缺点 111
7.5.2 cosmid质粒载体的制备 112
7.5.3 真核DNA片段的制备 113
7.5.4 cosmid载体与外源DNA片段的重组 113
7.5.5 cosmid文库的有效性分析 113
7.5.6 YAC文库的构建 113
8 克隆筛选与检测 116
8.1 重组克隆的初步筛选 116
8.1.1 重组克隆的遗传学检测法 116
8.1.2 报告基因技术的原理 117
8.1.3 基因工程中常用的报告基因 118
8.1.4 依赖于重组子结构特征分析的筛选方法 119
8.2 目的克隆的鉴定 120
8.2.1 分子杂交 120
8.2.2 免疫学检测 120
8.2.3 蛋白质活性和功能互补筛选 120
8.3 核酸分子杂交探针的概述 121
8.3.1 核酸探针的种类 121
8.3.2 寡核苷酸探针的序列要求 122
8.3.3 标记物的选择 123
8.3.4 核酸探针标记的两种基本方法 123
8.3.5 核酸探针的放射性标记 123
8.3.6 探针比放射活性的测定 129
8.3.7 非放射性探针标记方法 129
8.3.8 非放射性探针显色反应的检测 132
8.4 核酸分子杂交 132
8.4.1 膜上印迹杂交 133
8.4.2 Southern杂交 133
8.4.3 Northern杂交 135
8.4.4 其他杂交形式 135
8.5 获得目的基因的一些基本技术 136
8.5.1 根据特异蛋白质分离目的基因 137
8.5.2 用同源序列和已知基因序列分离目的基因 137
8.5.3 表达序列标签法分离目的基因 137
8.5.4 差异杂交法 139
8.5.5 cDNA扣除杂交和扣除文库 140
8.5.6 mRNA差异显示法 140
8.5.7 基因表达系列分析法 142
8.5.8 抑制差减杂交 143
8.5.9 DNA微阵列 144
8.5.10 噬菌体显示 145
8.5.11 酵母双杂合系统分析 146
9 外源目的蛋白质表达及其筛选 148
9.1 外源基因在E.coli中表达所必需的调控元件 148
9.1.1 外源基因表达要求一个复杂的系统 148
9.1.2 复制起始位点 149
9.1.3 调控型启动子 149
9.1.4 终止子 150
9.1.5 翻译调控元件 150
9.2 常见的E.coli表达载体的类型 150
9.2.1 非融合型表达的载体 150
9.2.2 分泌型表达载体 151
9.2.3 融合蛋白型表达载体 152
9.3 外源基因在大肠杆菌中表达形式 152
9.3.1 包涵体蛋白 153
9.3.2 融合蛋白 153
9.3.3 分泌型外源蛋白 153
9.4 外源基因在E.coli中的表达文库 154
9.4.1 λ载体构建外源基因的表达文库 155
9.4.2 受体菌 155
9.5 表达型克隆的筛选 155
9.5.1 筛选用的探针 155
9.5.2 放射免疫学检测 156
9.5.3 免疫荧光抗体法检测表达蛋白 157
9.5.4 免疫沉淀法检测表达蛋白 157
9.5.5 表达蛋白的Western印迹检测 157
9.5.6 外源基因瞬间表达的检测 158
9.5.7 通过双链DNA与表达产物相互作用来检测 159
9.5.8 翻译筛选法 159
9.5.9 利用蛋白质相互作用鉴定表达的cDNA克隆 160
9.5.10 进一步确定cDNA表达克隆 160
9.6 大肠杆菌表达系统 161
9.6.1 利用lacZ的pET表达系统 161
9.6.2 谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白表达系统 163
9.6.3 用碱性磷酸酯酶启动子和信号序列表达分泌蛋白 164
9.7 融合蛋白的分离和切割 165
9.7.1 化学裂解法 165
9.7.2 连接子设计有酶切位点和纯化序列 166
9.7.3 在谷胱甘肽-S-转移酶下游的酶切 166
9.7.4 麦芽糖结合融合蛋白的亲和层析分离 167
9.7.5 固定化的Ni2+吸附层析纯化含寡组氨酸标签的蛋白质 168
9.8 提高外源基因表达水平的措施 169
9.8.1 提高翻译水平 169
9.8.2 减轻宿主细胞的代谢负荷 170
9.8.3 提高表达蛋白的稳定性 170
9.9 包涵体重组蛋白的分离纯化 171
9.9.1 包涵体内蛋白质的分离 171
9.9.2 复性蛋白质的纯化 171
9.10 真核细胞表达系统 172
9.10.1 酿酒酵母表达系统 172
9.10.2 巴斯德毕赤酵母表达系统 173
9.10.3 昆虫细胞的杆状病毒表达系统 174
9.10.4 哺乳动物细胞表达系统 175
10 蛋白质工程原理 178
10.1 蛋白质工程的基本概念 178
10.1.1 蛋白质工程的定义 178
10.1.2 蛋白质工程的特性 178
10.1.3 蛋白质工程与相关领域的区别 179
10.1.4 蛋白质工程的主要难点 179
10.2 蛋白质工程设计原理 180
10.2.1 蛋白质突变体设计的一般步骤 180
10.2.2 蛋白质工程的流程 180
10.3 寡核苷酸引物介导的位点特异性定向突变 180
10.3.1 寡核苷酸引物介导的诱变 181
10.3.2 寡核苷酸介导的突变分子的富集 181
10.4 利用PCR产生定点突变 182
10.4.1 在基因序列的3′端和5′端区域产生突变 182
10.4.2 重叠延伸PCR 182
10.4.3 重叠延伸PCR导入取代、插入或缺失突变 183
10.5 基因片段取代突变 183
10.6 基因的体外分子进化 183
10.6.1 随机突变的盒式取代 184
10.6.2 易错PCR 185
10.6.3 基因DNA改组 185
10.7 蛋白质工程的设计和应用 186
10.7.1 蛋白质工程设计中一些重要的解决方案 186
10.7.2 提高蛋白质的稳定性 186
10.7.3 减少重组多肽的错误折叠 188
10.7.4 改变酶或蛋白质的结合特性 188
10.7.5 酶催化特异性的修饰 189
10.7.6 改善酶的催化活性 189
11 基因工程药物 191
11.1 基因工程蛋白质药物 191
11.1.1 重组人胰岛素 191
11.1.2 重组人生长激素 192
11.1.3 重组人干扰素 192
11.1.4 人白细胞介素 194
11.2 基因工程疫苗 195
11.2.1 基因工程疫苗的原理 195
11.2.2 重组乙肝疫苗 195
11.2.3 疫苗载体 196
11.3 基因工程抗体 196
11.3.1 天然抗体的局限性和基因工程抗体的策略 196
11.3.2 重组单克隆抗体 197
11.3.3 抗体基因片段的组合文库 197
11.3.4 人源性CDR序列重排建立免疫文库 198
11.3.5 小分子抗体 198
11.4 核酸类药物 199
11.4.1 反义核酸药物 200
11.4.2 RNA干扰 200
主要参考书目 202