中译本序 1
译者的话 1
前言 1
第一章利用重组DNA技术对植物进行遗传修饰 1
第一节引言 1
第二节植物遗传转化 1
一、DNA转移方法 1
目 录 1
第三节转基因植物获得的性状 3
一、抗昆虫性 3
二、转化植物的种类 3
二、抗病毒性 4
三、抗除草剂 4
四、抗逆性 5
五、种子储存蛋白的改良 6
六、果实成熟期的改变 7
七、改变花卉及观赏植物 7
八、细胞质雄性不育及自交不亲和 7
第四节未来的发展方向 8
参考文献 8
第二节突变体的类型 12
第一节引言 12
第二章以拟南芥菜为例产生和分析植物突变体 12
第三节诱变 14
一、诱变剂的选择 15
二、诱变剂量 16
三、样板程序 17
四、M1代种子库的利用：独立性和不育或致死突变 17
第四节突变体筛选和选择 21
一、生化突变体 21
二、发育突变体 22
一、单一座位上的复等位基因 23
第五节二次诱变 23
二、回复突变子和抑制子 24
第六节突变体分析 24
一、多次回交 24
二、遗传作图 25
三、剂量分析 25
四、嵌合性和细胞自主性 25
五、多基因座位和上位性 26
第七节结论 28
参考文献 28
一、DNA提取 30
第二节基因组DNA序列组成的测定 30
第三章DNA序列组成及基因拷贝数的测定 30
第一节引言 30
二、打断DNA及其分子量大小的检测 31
三、DNA复性 31
四、数据分析 32
五、散置序列模式的检测 32
六、重复DNA序列的大小分布 32
七、基因组中GC含量的测定 33
八、Cot曲线的分光光度法测定 33
九、复性DNA样品中双链DNA的测定 33
一、多基因家族的测定 34
第三节基因组中编码序列和非编码序列拷贝数的确定 34
二、基因拷贝数的确定 35
三、散置重复DNA序列拷贝数的确定 35
参考文献 36
第四章植物DNA的提取和鉴定 38
第一节引言 38
第二节CTAB法分离总DNA 39
第三节叶绿体DNA的分离 42
一、程序Ⅰ：高盐提取方案 42
二、程序Ⅱ：蔗糖梯度方案 43
三、程序Ⅲ：氯化铯密度梯度方案 43
第四节DNA滤膜杂交分析 44
一、DNA转移 45
二、与固定在滤膜上的核酸杂交 46
三、除去结合的探针重新进行杂交 47
参考文献 47
第五章植物mRNA的分离和鉴定 49
第一节引言 49
第二节方法 50
一、核糖核酸酶的失活或去除 50
二、总RNA的分离 51
三、多聚核糖体的分离 53
分离带多聚腺苷酸尾的poly（A）＋RNA 55
四、从总RNA或多聚核糖体RNA中 55
五、Northern Blot杂交 58
第三节讨论 62
参考文献 64
第六章向植物中导入外源基因的方法 66
第一节引言 66
第二节农杆菌天然基因转移系统 66
一、菌株和载体 68
二、选择标记和报告基因 69
三、农杆菌介导的叶盘转化 70
（一）一般的步骤、培养基配制和生长条件 70
（二）外植体来源和消毒 71
（四）卡那霉素抗性芽的切割和生根 74
（三）叶盘的制备及农杆菌的感染 74
（五）转化的鉴定和T-DNA拷贝数与结构的分析 75
第三节直接基因转移 76
一、微弹介导的转化 77
（一）无菌颗粒和DNA的准备 77
（二）轰击植物组织 79
第四节转化的植物 79
参考文献 82
第七章植物转化载体 88
第一节引言 88
一、关于植物转化的一般考虑 88
一、农杆菌介导的转移 89
第二节生物性转化载体 89
二、农杆菌载体系统 90
（一）共整合载体 91
（二）双元载体系统 93
第三节物理转化载体 94
一、细胞转化 94
二、细胞器转化 95
第四节选择标记和报告基因 97
一、遗传选择标记 97
二、生化标记 98
（一）组成型启动子 99
第五节影响基因表达的序列 99
一、5′调控序列 99
（二）诱导型启动子 100
（三）组织特异性／发育调控的启动子 101
二、其他5′调控序列 102
三、3′调控序列 102
（一）转录终止序列 102
四、内含子／外显子的影响 103
五、影响基因最佳表达的其他因素 103
六、亚细胞定位序列 103
二、改进的直接吸收转化策略 104
一、生物转化 104
第六节新方法 104
参考文献 105
第八章λ克隆文库的构建 118
第一节引言 118
第二节λ载体 119
一、λ置换型载体和基因组DNA的克隆 119
二、cDNA克隆及其载体 125
第三节利用λ载体构建基因组文库 126
一、用于克隆的植物基因组DNA的纯化 126
二、部分消化及分离合适大小的DNA片段 128
三、λ载体臂和筛选基因组片段的连接 130
第四节植物cDNA的制备 132
一、cDNA的合成 132
二、接头的连接反应及cDNA和λ载体臂的连接反应 134
第五节重组λ分子的体外包装 135
第六节λ克隆文库的筛选 136
第七节λ克隆文库的扩增和储存 140
参考文献 141
第九章基因在植物细胞中的瞬时表达分析 144
第一节引言 144
第二节原生质体制备 144
二、原生质体计数和活力测定 145
一、烟草叶片原生质体的分离 145
第三节DNA转染 146
一、PEG法 146
二、电击法 147
第四节报告基因的测定 149
一、GUS测定 149
参考文献 150
第十章植物转录启动子、增强子及终止子的分离和鉴定技术 152
第一节引言 152
第二节调控区的分离 153
一、用cDNA克隆方法分离调控区 153
第三节启动子和增强子元件的鉴定 154
二、从基因组克隆中分离调控区 154
三、示踪法分离启动子区 154
一、缺失分析 155
二、寡聚核苷酸介导的突变 156
三、结合因子 157
第四节终止子元件的特征 159
第五节报告基因 159
第六节瞬间表达分析 160
第七节稳定转化的分析 160
参考文献 161
第一节引言 163
第十一章应爪蟾卵母细胞检测植物基因表达 163
第二节爪蟾卵母细胞显微注射系统的建立 165
一、爪蟾卵母细胞的生物 165
二、爪蟾的饲养 166
三、卵母细胞的分离 166
四、显微注射的设备 168
第三节RNA显微注射 168
一、背景 168
二、RNA的制备 169
三、RNA显微注射方法 169
四、卵母细胞的放射性标记 169
二、DNA显微注射方法 170
一、背景 170
五、可溶性蛋白提取物的制备 170
第四节DNA显微注射 170
三、卵母细胞RNA的分离 171
第五节爪蟾卵母细胞在植物基因表达研究方面的其他应用 172
参考文献 173
第十二章植物组织中特异性mRNA的原位定位 175
第一节引言 175
第二节实验中需考虑的事项 175
三、杂交 176
（一）探针类型 176
二、载玻片的预处理 176
一、组织制备 176
（二）标记的选择 179
（三）杂交条件 179
（四）漂洗条件 180
四、杂交的检测 180
第三节组织制备的实验方法 180
一、所需设备和溶液 180
二、植物材料的固定 181
三、脱水 182
四、渗透 182
五、包埋 182
七、注意事项 183
六、切片 183
第四节用35S标记的RNA探针杂交的实验方法 184
一、前言 184
二、RNA探针的制备 184
（一）所需设备和溶液 184
（二）线性化 185
（三）硫标记的转录物的制备 186
（四）过柱纯化 186
（五）RNA转录物的水解 187
三、用35S标记的RNA探针探测组织切片 188
（一）所需设备和溶液 188
（二）载玻片的预处理 189
（三）组织切片的杂交 190
四、显微镜载玻片的放射自显影 192
（一）所需设备和溶液 192
（二）包被载玻片 193
（三）乳胶显影 193
五、放射自显影的载玻片的染色 193
（一）所需设备和溶液 193
（二）染色 193
（三）用GeniusTMRNA－标记试剂盒制备地高辛标记的探针 194
（二）DNA模板的线性化 194
（一）所需设备和溶液 194
一、探针的制备 194
第五节用地高辛标记的探针的杂交实验方法 194
二、杂交 195
（一）所需设备和溶液 195
（二）载玻片的制备 195
（三）预杂交 195
（四）杂交 195
（五）漂洗 195
三、用GeniusTM核酸检测试剂盒进行免疫反应 195
（一）所需设备和溶液 195
（二）方法 196
第六节附录 197
一、多聚－l－赖氨酸包被的载玻片的制备 197
二、DEPC处理玻璃和塑料器皿 197
三、溶液 197
（一）一般溶液 197
（二）放射性杂交所用的溶液 198
（三）非放射性杂交所需溶液 199
参考文献 200
第十三章植物中蛋白质表达的免疫学检测方法 203
第一节引言 203
一、蛋白质的纯化 204
第二节抗体的产生 204
二、免疫 205
三、采血、血清制备和储存 206
四、抗体纯化 207
五、多克隆和单克隆抗体 207
第三节Western印迹 208
一、Western印迹概述 208
二、电转移 209
三、封闭曝露的位点 210
四、第一抗体结合 210
五、用酶联第二抗体进行检测 210
（一）电转膜 211
六、抗体标记的检测及底物的加入 211
七、常规方法的一些改进 211
（二）缓冲液 212
（三）检测系统 212
（四）分子量的确定 212
（五）封闭溶液 213
（六）半干电转移 213
第四节免疫分析及筛选实验 214
一、概述 214
二、酶联免疫吸附实验 214
（二）双抗体三明治及抗体捕获 215
（一）竞争性抗原捕获 215
（三）抗体捕获及间接测定 216
三、斑点印迹和狭线印迹 216
参考文献 217
第十四章植物蛋白的原位免疫细胞化学定位 220
第一节引言 220
第二节植物蛋白的免疫细胞化学标记：原则、一般技术和局限性 221
一、植物细胞蛋白免疫细胞化学的原则 221
二、组织处理 222
（一）标准的固定方法 222
三、抗体探针的制备及检测 223
（三）包埋方法 223
（二）微波固定法 223
四、后包埋标记技术 224
（一）胶体金 224
（二）金标记蛋白A 224
（三）金标记的二级抗体 225
（四）标记方法 225
五、用于蛋白原位定位的其他抗体方法 225
第三节植物组织中特异性蛋白的免疫细胞化学定位 226
一、小麦胚溶菌酶的原位定位 226
二、受镰刀菌感染的番茄根组织中蔗糖酶的原位定位 226
（一）几丁质酶和β-1,3－葡萄糖苷酶的金标记免疫定位 227
三、病原相关蛋白的原位定位 227
（二）PR-1蛋白的免疫金定位 229
四、不同植物组织中富含羟脯氨酸的糖蛋白的原位定位 230
五、植物组织中其他蛋白的原位定位 231
第四节结论和展望 233
参考文献 233
第十五章分子生物学计算机软件的获取 237
第一节准备 237
第二节通过电子函件获取软件 238
第三节通过匿名FTP获取软件 240
第四节通过“蜗牛”邮寄获取软件 241
第五节求助于ARCHIE 242
第六节保持消息灵通 243
第十六章序列相似性查找、多重序列对比和分子树构建 245
第一节引言 245
第二节序列相似性查找 245
第三节多重序列对比 253
第四节分子树构建过程 257
一、使用多重序列对比进行距离矩阵分子树构建 257
二、同时对比和构建系统发育树 258
三、吝啬法构建分子树 258
第五节注意事项 259
参考文献 260
第十七章植物DNA作图 261
第一节引言 261
一、基于RFLP的DNA作图 261
二、基于PCR的DNA作图 261
第二节程序 262
一、基于RFLP的DNA作图 262
（一）探针制备 262
（二）用于RFLP分析的植物DNA制备 264
（三）RFLP分析 267
二、基于PCR的DNA作图 269
（一）亲本和分离群体的DNA提取 269
（二）PCR-RAPD反应 272
（三）电泳分析扩增产物及筛选有用引物 274
（四）分离分析和遗传作图 274
第三节结论 274
参考文献 274
第十八章随机扩增多态性DNA（RAPD）分析 277
第一节引言 277
第二节聚合酶链式反应标记 278
一、扩增序列多态性（ASPs） 278
二、半随机引物 278
三、随机引物 278
一、DNA提取 280
第三节RAPD方法学 280
二、扩增方法 281
三、凝胶电泳分离扩增产物 284
第四节RAPD分析 287
一、DNA分群 287
二、连锁 288
三、一致性／相关性分析 289
参考文献 289
十九章植物病原检测与鉴定 292
第一节引言 292
第二节病毒 292
二、用组织印迹杂交分析方法检测植物病毒 295
一、用组织印迹免疫分析方法检测植物病毒 295
三、用单管PCR扩增程序检测植物病毒或类病毒 296
第三节真菌 296
一、用DNA探针检测被感染植物组织中的真菌 298
第四节细菌 299
一、用DNA探针检测植物病斑中的细菌 301
第五节软体纲病原菌 302
一、用DNA探针检测被感染植物中的MLOs 304
二、用DNA探针检测被感染昆虫中的MLOs 304
参考文献 305