实验计划表 1
导论 5
1 基因文库的构建 25
1-1 染色体DNA的提取 25
1-2 总RNA和mRNA的提取 33
1-3 λ噬菌体DNA的提取 40
1-4 染色体DNA的部分消化 46
1-5 基因组文库的构建 48
1-6 cDNA合成 52
1-7 cDNA文库的构建 58
2 目的基因的获得 64
2-1 PCR扩增 64
2-2 核酸电泳 74
2-3 目的基因片段的获得 81
2-4 核酸探针的标记及检测 83
2-5 核酸探针筛选基因文库 92
2-6 反转录PCR 97
2-7 RACE PCR 103
2-8 反向PCR 110
2-9 Sitefinding-PCR 114
3 载体质粒的制备 119
3-1 质粒DNA的提取与纯化 119
3-2 核酸纯度、浓度与相对分子质量的测定 128
4 扩增质粒的构建 133
4-1 限制性内切酶的酶切反应 133
4-2 凝胶电泳法进行DNA的分离与纯化 140
4-3 DNA片段的体外连接 143
4-4 T-A克隆 149
5 重组DNA导入宿主细胞 153
5-1 感受态细胞的制备 153
5-2 重组质粒的转化 158
5-3 外源基因在毕赤酵母中的转化与整合 163
6 重组子的筛选与鉴定 169
6-1 阳性克隆的筛选 169
6-2 DNA序列测定 175
6-3 序列同源性分析 181
6-4 DNA印迹 183
6-5 菌落原位杂交 193
6-6 荧光原位杂交 196
7 表达质粒的构建与诱导表达 201
7-1 表达质粒的构建与转化 201
7-2 RNA印迹 212
7-3 外源基因的诱导表达 217
7-4 蛋白质浓度的测定 222
7-5 SDS-PAGE 227
7-6 蛋白质印迹 236
8 蛋白质样品的分析 243
8-1 等电聚焦电泳 243
8-2 双向电泳 246
8-3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 257
8-4 酶联免疫吸附测定（ELISA） 261
8-5 蛋白质生物功能测定 263
8-6 酶活性的测定 264
9 工程菌的培养与目的产物分离 267
9-1 发酵条件的优化 267
9-2 包含体的复性 270
9-3 诱导表达蛋白质的分离沉淀 274
9-4 凝胶过滤层析 281
9-5 离子交换层析 288
9-6 亲和层析 295
附录1 简写 303
附录2 实验注意事项 307
附录3 如何撰写实验报告 311
附录4 常用碱基、氨基酸符号及缓冲液 313
附录5 大肠杆菌基因型 316
附录6 培养基与试剂的配制 318
附录7 实验仪器 329
参考文献 331