第一章 抗体的制备技术 1
第一节 多克隆抗体的制备（抗血清的制备技术） 1
一、免疫动物的选择 1
二、抗原的准备和免疫原的注射剂量 1
三、佐剂 2
四、免疫方案 2
五、免疫效价的检测 2
六、抗体的纯化 2
七、抗体的保存 7
第二 节单克隆抗体的制备（杂交瘤技术） 7
一、基本原理 7
二、制备过程 8
第三 节基因工程抗体技术 14
一、人－鼠嵌合抗体 15
二、小分子抗体 18
三、抗体库技术 21
四、基因工程抗体的表达，纯化及活性测定 21
第二章 免疫亲和层析技术 27
第一节 免疫亲和层析的基本过程 27
一、概要 27
二、操作步骤 28
第二节 免疫亲和层析的主要影响因素 29
一、影响免疫亲和层析纯化效果的因素 29
二、免疫亲和层析使用的抗体 29
第三节 免疫亲和层析的操作方案 31
一、免疫亲和层析程序方案概述 31
二、抗体亲和层析柱的制备 31
三、抗原与抗体－微珠基质的结合 37
四、从免疫亲和层析柱上洗脱抗原 39
一、样本的制备 43
第三章 免疫印迹 43
第一节蛋白质的电泳分离 43
二、蛋白质凝胶电泳 47
第二节 将蛋白质从凝胶中转印至膜上 49
一、以PVDF膜为固相载体的半干转印法 49
二、转印后切取印迹膜 50
三、印迹膜蛋白染色 51
第三节 免疫检测 51
一、印迹膜上非特异性蛋白质结合位点的封闭 52
二、直接与间接检测方法 52
第四节 免疫印迹中需要注意的问题 54
一、抗体的性质 54
二、样品中待检测蛋白质的含量 54
三、背景问题 54
四、转印效率低 55
五、设置对照与解释结果 56
六、免疫印迹技术的灵敏度 56
第四章 免疫标记技术 57
第一节 免疫荧光标记技术 57
一、荧光抗体的制备 57
二、荧光标记技术的应用 60
第二节 免疫酶技术 64
一、酶标抗体的制备 65
二、酶－抗酶复合物的制备 68
三、酶标抗体和酶－抗酶复合物的应用 69
第三节 放射性核素标记技术 74
一、放射性核素标记 74
二、放射性核素标记技术的应用 77
一、胶体金的制备 81
第四节免疫金标记技术 81
二、胶体金标记蛋白的制备 82
三、胶体金标记技术的应用 84
第五章 免疫学中常用的PCR技术 88
第一节 PCR基本原理和标准方法 88
一、PCR基本原理 88
二、标准PCR方法 88
第二节 PCR反应体系的组成及优化 90
一、模板 90
二、寡聚核苷酸引物 90
三、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) 91
四、Mg2+的浓度 91
五、耐热DNA聚合酶 91
七、污染的对策 92
六、循环参数 92
八、其他优化策略 93
九、PCR常见问题及处置 93
第三节 PCR反应模板的制备 93
一、细菌DNA的制备 94
二、全血标本DNA制备 94
三、白细胞标本DNA制备 95
四、临床拭子标本的DNA制备 97
五、固定和包埋的组织标本的DNA制备 97
六、微量和特殊标本的DNA制备 99
七、体外培养细胞和组织细胞DNA的提取 100
八、凝胶中PCR产物的再扩增标本制备 101
九、RNA标本的制备 102
第四节 PCR产物的检测 102
一、凝胶电泳分析法 102
二、点杂交 103
三、PCR-ELISA法 105
第五节 免疫学中的特殊PCR技术 106
一、免疫PCR(IM-PCR) 106
二、定量PCR 109
三、原位PCR(In situPCR) 112
第六节 PCR技术在免疫学中应用 115
一、PCR在淋巴细胞抗原受体研究中的应用 115
二、在HLA分型、细胞因子检测和基因工程抗体的制备中的应用 118
第六章 免疫细胞的分离 120
第一节 免疫细胞的分离的原理和手段 120
一、基于细胞物理性状的分离方法 120
二、基于细胞表面标记的分离方法 121
第二节 各种免疫细胞的分离与纯化 122
一、外周血白细胞的分离和纯化 122
二、外周血单个核细胞的分离 124
三、淋巴细胞的分离 125
四、T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离 126
五、T细胞亚群的分离 129
六、NK细胞的分离 132
七、单核细胞分离 134
八、人外周血中性粒细胞制备 135
九、嗜碱性粒细胞的分离 136
十、嗜酸性粒细胞的分离 137
十一、组织肥大细胞的分离 137
十二、树突状细胞（DC） 138
十三、红细胞的分离 139
第七章 免疫细胞功能的检测 141
第一节 免疫细胞数量的检测 141
一、通过检测表面标志（CD分子）检测各类免疫细胞的数量 141
二、抗原特异性T细胞数量的检测——MHC／多肽四聚体法 145
一、T、B淋巴细胞增殖反应 146
第二节 T、B淋巴细胞功能测定 146
二、混合淋巴细胞培养 148
三、细胞毒性T细胞胞毒功能测定 149
四、B细胞功能的测定 152
五、LAK/TIL细胞的活性测定 155
第三节 NK细胞活性测定 157
一、同位素释放法 157
二、乳酸脱氢酶释放试验 159
第四节 中性粒细胞功能测定 160
一、中性粒细胞吞噬功能的测定 160
二、中性粒细胞粘附功能的测定 160
——琼脂糖平板法 161
四、中性粒细胞杀菌功能的检测——全血化学发光测定法 161
三、中性粒细胞移动功能的测定 161
五、硝基蓝四氮唑（NBT）还原能力的测定 162
第五节 单核－巨噬细胞功能测定 162
一、单核－巨噬细胞胞毒作用的检测 163
二、单核－巨噬细胞趋化功能的检测 164
三、巨噬细胞吞噬功能测定——皮泡法 165
第六节 嗜碱性粒细胞功能和红细胞免疫功能的测定 166
一、嗜碱性粒细胞功能的测定——嗜碱性粒细胞脱颗粒试验 166
二、红细胞免疫功能的测定 167
第八章 细胞因子及其受体的检测 169
第一节 细胞因子的生物活性检测法 169
一、IL-1的生物活性检测法 170
二、IL-2的生物活性检测法 175
三、TNF的生物活性检测法 179
一、TNF的免疫学检测法 181
第二节 细胞因子及其受体的免疫学检测法 181
二、IL-2R的免疫学检测法 184
三、细胞内（胞浆）细胞因子的免疫学检测法 188
第三节 细胞因子的分子生物学检测法 189
一、斑点杂交法测定培养细胞IL-2 mRNA的含量 189
二、原位杂交法测定TNF的mRNA 196
三、反转录PCR（RT-PCR）定量检测细胞因子的mRNA 198
第九章 细胞凋亡的检测方法 200
第一节 细胞凋亡的形态学检测方法 200
一、普通光学显微镜检测法 200
二、荧光显微镜检测法 202
三、电子显微镜检测法 207
四、凋亡指数和细胞活力的定量测定（荧光染色法） 207
一、基于细胞凋亡时DNA变化的检测方法 208
第二节 细胞凋亡检测的生物化学方法 208
二、基于凋亡诱导蛋白酶变化的细胞凋亡检测 209
第三节 免疫学方法（ELISA） 211
第四节 原位末端转移酶标记技术 212
一、荧光标记法 212
二、酶标记法 213
第五节 靶细胞DNA片段的定量分析与杀伤细胞介导的细胞溶解试验 214
第六节 流式细胞分析术检测细胞凋亡 215
一、流式细胞分析术检测细胞凋亡的基本原理 215
二、流式细胞分析术检测细胞凋亡的常用方法 216
第七节 细胞凋亡的相关蛋白分析 219
一、Fas抗原的检测 219
二、Bcl-2原癌基因的检测 221
三、P53蛋白检测 222
一、标本基因组DNA提取 225
第一节 PCR-SSO HLA分型技术 225
第十章 HLA分型技术 225
二、HLA等位基因序列特异性探针（SSO）及其标记 226
三、PCR扩增标本的HLA-DR基因 228
四、扩增DNA固定于尼龙膜上 228
五、预杂交和杂交 229
六、洗膜 229
七、结果显示 230
八、结果分析 230
第二节 PCR-RFLP HLA分型技术 230
一、待测样本基因组DNA的提取 232
二、PCR扩增样本DNA的HLA基因片段 232
三、PCR扩增产物的RFLP分析 233
四、结果分析 234
二、PCR-SSP扩增体系的组成和准备 235
一、标本基因组DNA提取 235
第三节 PCB-SSP HLA分型技术 235
三、PCR-SSP扩增 237
四、琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物 238
五、结果分析 238
第四节 常用HLA DNA分型技术的特点和选用 239
一、常用HLA DNA分型技术的特点 239
二、常用HLA DNA分型技术的选用 240
第十一章 T细胞克隆技术和HLA／抗原肽四聚体制备技术 241
第一节 T细胞克隆技术 241
一、抗原特异性T细胞克隆的制备 241
二、抗原非特异性T细胞克隆的制备 242
三、鼠T细胞克隆的制备 242
四、利用HLA／抗原肽四聚体和流式细胞分选仪制备CTL细胞克隆 244
第二节 HLA／抗原肽四聚体制备技术 246
一、HLA-I类分子单体的制备和纯化 247
二、MHC-I单体的生物素化和纯化鉴定 251
三、四聚体的制备及应用 254
第十二章 噬菌体展示技术 257
第一节 噬菌体展示技术基本原理 257
一、噬菌体展示技术的应用原理 257
二、噬菌体展示载体构建原理 258
第二节 噬菌体展示技术筛选单链抗体 258
一、噬菌体展示抗体库的构建 258
第三节 噬菌体展示技术筛选多肽 267
一、噬菌体肽库的构建 267
二、筛选多肽 267
三、噬菌体滴度的测定 271
四、噬斑的扩增 271
六、ELISA检测筛选到的靶分子结合肽 272
五、测序模板的快速纯化 272
七、影响筛选的因素 274
第四节 噬菌体肽库的应用 274
一、在生物活性小肽筛选方面的应用 274
二、在抗原表位研究中的应用 274
三、在人工抗体合成中的应用 275
四、展望 275
附录 276
附录一 细胞爬片、甩片或切片的制备和固定 276
附录二 蛋白质定量与凝胶染色 278
附录三 常用蛋白酶和蛋白酶抑制剂 281
附录四 常用发色底物 283
附录五 Tris－甘氨酸SDS聚丙烯酰胺电泳凝胶的配制 284
附录六 实验用小鼠的品系 286
附录七 常用溶液的配制 286