目 录 1
第一章载体－宿主体系 1
质粒 1
在质粒中进行克隆 9
噬菌体λ 13
裂解循环 13
溶源性 16
λ噬菌体载体的构建 17
选择合适的载体 18
噬菌体λ载体图 19
粘粒 29
单链噬菌体 41
噬菌体M13载体 42
总结 43
第二章细菌菌株与病毒的繁殖和保存 46
菌株的检验 46
单菌落的分离 46
细菌菌株的生长、保存和保藏 48
噬菌体λ噬菌斑的纯化 49
从单斑制备噬菌体λ原液 50
培养基和抗生素 52
液体培养基 52
含琼脂或琼脂糖的培养基 54
抗生素 54
感染 57
第三章噬菌体λ和质粒DNA的分离 57
噬菌体λ的大量制备 57
诱导 58
噬菌体λ的提纯 59
噬菌体λDNA的提取 62
质粒DNA的大量分离 63
细菌的生长和质粒的扩增 63
菌体的采集和裂解 64
利用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心提纯闭环DNA 66
从质粒DNA制品中去除RNA 67
限制酶 69
同裂酶 69
第四章分子克隆中所用的酶 69
甲基化作用 70
用限制酶消解DNA 74
分子克隆中使用的其它酶类 75
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 76
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段 79
T4 DNA聚合酶 82
用T4多核苷酸激酶标记DNA 5′末端 86
依赖于RNA的DNA聚合酶 90
DNA的脱磷酸作用 93
核酸酶Bal 31 95
核酸酶Sl 97
核糖核酸酶类 98
绿豆核酸酶 98
核酸外切酶Ⅶ 99
核酸外切酶Ⅲ 99
脱氧核糖核酸酶Ⅰ 99
λ核酸外切酶 101
多聚（A）聚合酶 101
T4 DNA连接酶 102
T4 RNA连接酶 102
EcoRI甲基化酶 103
末端脱氧核苷酸转移酶 103
第五章凝胶电泳 104
琼脂糖凝胶电泳 104
缓冲液 106
凝胶电泳槽 106
琼脂糖凝胶的制备 110
琼脂糖凝胶中DNA的染色 111
摄影技术 112
微型凝胶 112
从琼脂糖凝胶中回收DNA 113
碱性琼脂糖凝胶 117
聚丙烯酰胺凝胶电泳 118
聚丙烯酰胺凝胶的制备 118
从聚丙烯酰胺凝胶中分离DNA片段 121
分离链的凝胶 121
利用聚丙烯酰胺凝胶分离链 122
利用琼脂糖凝胶分离链 123
利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离短的双链DNA的链 124
第六章真核细胞mRNA的抽提、提纯和分析 126
哺乳动物细胞mRNA的分离 128
细胞总RNA的分离 129
多聚（A）+RNA的选择 131
RNA的凝胶电泳 132
RNA的核酸酶Sl定位 137
第七章 cDNA的合成和克隆 140
cDNA的合成 140
第一cDNA链的合成 140
第二cDNA链的合成 141
利用核酸酶Sl切割发夹环 142
双链cDNA的分子克隆 143
同聚物尾序 143
合成的DNA接头 144
克隆cDNA的其它方法 145
cDNA克隆的策略 148
高丰度mRNA 148
低丰度mRNA 148
cDNA克隆的程序 151
双链cDNA的合成 151
用核酸酶Sl消解 156
双链cDNA的克隆 157
将载体和双链cDNA进行退火 159
通过依次加合接头来克隆双链cDNA 160
利用质粒DNA转化大肠杆菌 163
利用氯化钙程序转化 163
第八章将质粒和噬菌体λDNA引入大肠杆菌 163
利用氯化钙／氯化铷程序转化 164
大肠杆菌χ1776的转化 165
噬菌体λDNA的离体包装 167
噬菌体λ溶源菌的保持和测定 168
包装抽提物制备方案Ⅰ 169
离体包装方案Ⅰ 170
包装抽提物制备方案Ⅱ 171
离体包装方案Ⅱ 173
噬菌体λ载体中基因组文库的构建 175
第九章基因组文库的构建 175
载体DNA的制备 178
从组织培养生长的细胞中分离大分子量真核DNA 181
真核DNA 20 kb片段的制备 182
连接和包装 184
文库的扩增 188
粘粒载体基因组文库的构建 189
磷酸酯酶处理的粘粒载体中的克隆 190
用两种限制酶消解和磷酸酯酶处理过的粘粒载体中的克隆 192
粘粒文库的扩增、贮存和筛选 195
第十章重组克隆的鉴定 198
细菌菌落或噬菌斑的原位杂交 198
筛选小量细菌菌落 199
将菌落复印在硝酸纤维素滤膜上 201
利用杂交筛选噬菌体λ噬菌斑 202
噬菌体λ噬菌斑原位扩增后通过杂交进行筛选 204
固定在滤膜上的DNA或RNA与放射性探针杂交 205
与带有噬菌斑或菌落复印的硝酸纤维素滤膜杂交 206
利用杂交选择来鉴定cDNA克隆 208
利用与硝酸纤维素相结合的DNA进行杂交选择 208
杂交选择的RNA在网织红细胞裂解液中转译 215
注入到蛙卵母细胞的信使RNA的转译 219
利用大肠杆菌中的重组，从噬菌体λ文库中筛选特异性DNA序列 221
利用重组进行选择的原理 221
在W3110r-m+（p3）（πVX）上进行噬菌体λ文库平板测定 224
含有校正基因的噬菌体的遗传测定 224
在πVX筛选中使用的菌株 224
W3110 r-m+（p3）的转化 224
πVX的制备 224
πVX系统的测定 225
πVX系统的利用 227
第十一章重组体DNA克隆的分析 228
质粒或噬菌体λDNA的快速分离 228
快速分离小量质粒DNA 228
快速分离小量噬菌体λ DNA 230
作限制酶切位点图 232
一次和多次消解作图 232
依次消解 233
部分消解 234
Southern转移 236
DNA从琼脂糖凝胶转移到硝酸纤维素滤膜上 237
Southern滤膜杂交 239
小片段DNA次级克隆到质粒载体中 241
利用粘性末端次级克隆DNA片段 241
在次级克隆中利用合成的DNA接头 241
连接两个平端末端DNA分子以创建限制性位点 245
进行快速依次克隆的步骤 246
第十二章在大肠杆菌中表达克隆DNA的载体 248
启动子 248
利用噬菌体λPL启动子的载体 249
其它启动子 251
核糖体－结合位点 251
真核基因的表达 252
表达非融合的真核蛋白的载体 252
表达融合的真核蛋白的载体 257
克隆基因的最大表达 265
增加基因剂量 265
总结 266
附录 267
1：生化技术 267
玻璃器皿和塑料器皿 267
液体培养基 268
有机试剂的配制 268
用于噬菌体λ工作的溶液 270
抗生素 271
缓冲液和溶液的配制 273
蛋白水解酶类 274
酶类 274
限制酶消解缓冲液 276
常用电泳缓冲液 276
常用凝胶载样缓冲液 277
透析管的准备 278
从乙醇和水混合液中干燥32P－标记的核苷酸 278
核酸的纯化 279
核酸的浓缩 280
Sephadex G-50层析 282
DNA和RNA的定量 284
放射自显影 285
核酸中放射性的测量 287
制备质粒多种聚合体作为分子量参照物 288
用Maxam-Gilbert技术定序的方案 288
2：pBR322 291
pBR 322的核苷酸序列 291
pBR 322的限制切点 299
pBR 322 DNA的限制片段 304
3：常用细菌菌株 314
4：厂商地址和产品简介 315
参考文献 319