第1章 绪论 1
1.1 蛋白质的研究历史 1
1.2 蛋白质的理化性质和生物学特性 1
1.3 蛋白质纯化手段的历史回顾 2
1.4 纯化蛋白的应用 2
参考文献 3
第1部分 材料的预处理和蛋白质的粗提 6
第2章 不同来源材料的预处理 6
2.1 不同材料的预处理 6
2.1.1 植物材料的预处理 7
2.1.2 动物材料的预处理 7
2.1.3 微生物材料的预处理 8
2.2 细胞的破碎 8
2.2.1 机械法 9
2.2.2 非机械法 11
方案2.1 超声波法提取烟草叶中的3-磷酸甘油脱氢酶 12
方案2.2 从猪胰脏中提取胰凝乳蛋白酶 13
方案2.3 从大肠杆菌中提取诱导表达的（His）6-X 14
参考文献 16
第3章 蛋白质的沉淀 17
3.1 盐析法 17
3.2 有机溶剂沉淀法 18
3.3 等电点沉淀法 19
3.4 非离子多聚物沉淀法 19
3.5 选择性沉淀法 20
方案3.1 用盐析法选择性沉淀蛋白质 21
方案3.2 用有机溶剂沉淀蛋白质 22
方案3.3 使用蛋白质排阻和拥挤剂选择性沉淀蛋白质 23
参考文献 24
第4章 蛋白质的浓缩 26
4.1 吸附法 26
4.2 超滤法 27
4.3 沉淀法 28
4.4 透析法 28
4.5 冷冻干燥法 28
4.6 双水相分离法 29
方案4.1 用透析袋进行脱盐、浓缩和更换缓冲液 29
方案4.2 用不对称圆盘膜超滤进行浓缩或透析 31
参考文献 32
第2部分 色谱法分离纯化蛋白质 35
参考文献 35
第5章 凝胶过滤色谱 36
5.1 基本原理 36
5.2 实验方案设计 37
5.2.1 凝胶介质的选择 37
5.2.2 凝胶介质的预处理 37
5.2.3 色谱柱的选择 38
5.2.4 凝胶柱的装填 38
5.2.5 样品处理和上样 38
5.2.6 洗脱和收集 39
5.2.7 色谱柱的清洗、再生与保存 39
方案5.1 用凝胶过滤色谱更换缓冲液 39
方案5.2 凝胶过滤色谱分离三种分子量不同的蛋白质 41
参考文献 43
第6章 离子交换色谱 44
6.1 基本原理 44
6.2 实验方案设计 46
6.2.1 离子交换介质的选择 46
6.2.2 流动相的选择 47
6.2.3 色谱柱的选择 47
6.2.4 离子交换剂预处理和装柱 47
6.2.5 加样 48
6.2.6 洗脱 48
6.2.7 洗脱组分的收集和分析 49
6.2.8 离子交换剂的再生、清洗与储存 49
方案6.1 弱阴离子交换色谱和强阳离子交换色谱在分离纯化单克隆抗体中的应用 49
参考文献 53
第7章 亲和色谱 54
7.1 基本原理 54
7.2 亲和色谱的几种类型 55
7.2.1 金属螯合亲和色谱 55
7.2.2 免疫亲和色谱 56
7.2.3 凝集素亲和色谱 56
7.3 实验方案设计 56
7.3.1 亲和吸附剂的选择 56
7.3.2 装柱 56
7.3.3 上样 57
7.3.4 吸附 57
7.3.5 流速和清洗 57
7.3.6 洗脱 57
7.3.7 再生和保存 58
方案7.1 亲和色谱纯化抗体融合蛋白 58
方案7.2 金属螯合亲和色谱分离大肠杆菌重组表达的蛋白 61
方案7.3 从大肠杆菌中提取诱导表达的GST标签融合蛋白 63
参考文献 65
第8章 疏水色谱 66
8.1 基本原理 66
8.2 实验方案设计 67
8.2.1 疏水配基的选择 67
8.2.2 离子强度及种类 67
8.2.3 破坏水化作用的物质 68
8.2.4 温度 68
8.2.5 洗脱方式 68
8.2.6 表面活性剂 68
8.2.7 色谱柱使用后的处理 69
方案8.1 用疏水色谱去除抗体融合蛋白样品中的多聚体 69
参考文献 72
第9章 分子印迹技术 73
9.1 分子印迹主要术语 74
9.1.1 功能单体 74
9.1.2 交联剂 74
9.1.3 溶剂和致孔剂 75
9.1.4 引发剂 75
9.1.5 适用的印迹分子 76
9.2 分子印迹的分类 76
9.2.1 共价型 76
9.2.2 非共价型 77
9.3 印迹效率的评价 77
9.3.1 保留因子 77
9.3.2 分离因子 77
9.3.3 分离度 77
9.3.4 等温吸附方程 78
9.3.5 经典孔径分布曲线 78
9.3.6 吸附曲线 78
9.3.7 其他手段 78
9.4 分子印迹技术在蛋白质分离中的展望 78
方案9.1 溶菌酶分子印迹的制备和应用 80
方案9.2 血红蛋白分子印迹的制备和应用 83
参考文献 86
第10章 高效液相色谱法分离纯化蛋白质 88
10.1 高效液相色谱的基本原理和分类 88
10.1.1 与经典液相（柱）色谱法比较 88
10.1.2 高效液相色谱法的特点 88
10.1.3 高效液相色谱仪 89
10.1.4 高效液相色谱常用参数 90
10.1.5 高效液相色谱仪标准操作规程 92
10.2 常用流动相的极性和选择 94
10.2.1 何谓流动相 94
10.2.2 流动相的性质要求 94
10.2.3 流动相的选择 95
10.2.4 准备流动相的一般过程 95
10.2.5 卤代有机溶剂应特别注意的问题 97
10.2.6 HPLC用水 97
10.2.7 常用流动相组分的物理特性 97
10.3 常用检测器 97
10.3.1 概述 97
10.3.2 检测器的性能指标 98
10.3.3 各类检测器 99
10.4 特异性蛋白专用柱特点和操作 106
10.4.1 固定相 106
10.4.2 色谱类型 106
10.4.3 常用键合相的表面化学结构 107
10.4.4 色谱柱 107
10.5 常见故障排除 109
10.5.1 与色谱柱相关的问题 109
10.5.2 造成色谱峰（不对称）拖尾的原因 110
10.5.3 如何解决峰形拖尾的问题 110
10.5.4 如何贮存色谱柱 111
10.5.5 谱图问题 111
10.5.6 常见故障 111
10.6 高效液相色谱在蛋白质分离纯化中的应用实例 115
10.6.1 反相色谱分离蛋白质 115
方案10.1 肽类酶解混合物色谱过程 117
方案10.2 蛋白质样品纯化色谱过程 118
方案10.3 白细胞介素-2反相高效液相色谱纯化 119
方案10.4 水蛭素12肽的反相高效液相色谱纯化 120
10.6.2 疏水作用色谱 121
方案10.5 高效疏水作用色谱分离纯化四种蛋白质纯品 125
方案10.6 人唾液蛋白的高效疏水色谱分离纯化 126
方案10.7 疏水作用色谱法同时纯化及复性基因重组人干扰素 127
10.6.3 高效离子交换液相色谱法纯化蛋白质分子 128
方案10.8 高效阴离子交换液相色谱法 129
方案10.9 高效阳离子交换液相色谱法 130
方案10.10 高效离子交换色谱法分离皖南尖吻蝮蛇毒活性组分 131
方案10.11 高效离子交换色谱（HPIEC）分离经HPHIC分离后的微粒体P450 132
10.6.4 高效排阻液相色谱法纯化蛋白质分子 133
方案10.12 高效体积排阻液相色谱基本操作程序 135
方案10.13 重组人粒细胞集落刺激因子分子量测定 136
参考文献 137
第11章 毛细管电色谱及其在蛋白质分离纯化中的应用 138
11.1 毛细管电色谱 138
11.2 毛细管电色谱技术历史回顾 138
11.3 毛细管电色谱基本分离模式 139
11.3.1 开管柱电色谱 139
11.3.2 填充柱电色谱 140
11.3.3 整体柱电色谱 140
11.3.4 CEC分离模式的选择 141
11.3.5 CEC、CE和HPLC的对照分析 141
11.4 毛细管电色谱在蛋白分离分析中的新技术 142
11.4.1 在线样品预浓集-毛细管电色谱联用技术 142
11.4.2 毛细管电色谱-质谱联用技术在蛋白分离分析中的应用 143
11.5 毛细管电色谱基本术语和原理 143
11.5.1 电迁移和电渗、电渗流、电动现象、焦耳热效应 143
11.5.2 保留机制和分离机理 143
11.6 毛细管电色谱仪器 144
11.6.1 毛细管电色谱仪器的基本要求 144
11.6.2 基本装置 145
11.6.3 检测系统 145
方案11.1 离子交换电色谱纯化蛋白质的研究 146
方案11.2 微流控芯片-多维毛细管电色谱分离牛血清白蛋白酶消解产物 150
方案11.3 毛细管电色谱耦合飞行时间质谱分离鉴定卵清蛋白的酶解产物 153
参考文献 154
第12章 其他色谱分析方法简介 156
12.1 超临界流体色谱 156
12.1.1 超临界流体简介 156
12.1.2 超临界流体色谱简介 156
12.1.3 SFC的流动相 156
12.1.4 SFC的固定相 157
12.1.5 SFC的检测系统 157
12.1.6 联机分析与定性 158
12.2 逆流色谱 158
12.2.1 简介 158
12.2.2 逆流色谱的特点 159
12.2.3 溶剂体系的选择和制备 159
12.2.4 CPC的检测仪器 160
12.3 亲水色谱 160
12.3.1 简介 160
12.3.2 HILIC的特点 160
12.3.3 HILIC固定相 161
12.3.4 展望 162
12.4 快速色谱 162
12.4.1 简介 162
12.4.2 快速色谱原理与系统组成 162
12.4.3 与制备HPLC的关系 163
参考文献 163
第3部分 电泳法分离纯化蛋白质 166
第13章 聚丙烯酰胺凝胶电泳 166
13.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳常用溶液及配制 166
13.2 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 167
13.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 167
13.4 聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳 169
13.5 小分子多肽凝胶电泳 170
13.6 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 170
13.7 聚丙烯酰胺凝胶中蛋白的回收 170
方案13.1 SDS变性电泳分析牛血清白蛋白（BSA） 171
方案13.2 BSA变性梯度胶电泳方案 173
方案13.3 小分子多肽（抗菌肽）凝胶电泳 174
方案13.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 175
参考文献 177
第14章 聚丙烯酰胺等电聚焦 178
14.1 聚丙烯酰胺等电聚焦具有高分辨率的特点 178
14.2 等电聚焦pH梯度的形成 178
14.3 等电聚焦电泳板式 179
方案14.1 HeLa细胞裂解液等电聚焦 179
参考文献 181
第15章 双向电泳 182
15.1 样品的制备 182
15.2 IPG的选择和上样 183
15.3 第一向电泳：等电聚焦电泳（IEF） 183
15.4 IPG胶条平衡 184
15.5 采用垂直系统进行第二向电泳：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 184
方案15.1 HeLa细胞周期依赖性蛋白表达和修饰的分析 184
参考文献 186
第4部分 蛋白质纯化效果的评价和蛋白质分析 188
第16章 蛋白质浓度、纯度及活性的分析 188
16.1 测定蛋白质浓度的方法简介 188
16.1.1 凯氏定氮法 188
16.1.2 双缩脲法 188
16.1.3 Lowry法 189
16.1.4 紫外分光光度法 189
16.1.5 考马斯亮蓝染色法 190
16.1.6 BCA检测法 190
16.2 测定蛋白质纯度的方法简介 190
16.2.1 电泳法 190
16.2.2 色谱法 190
16.2.3 免疫化学法 190
16.3 测定蛋白质活性的方法简介 191
方案16.1 双缩脲法测定未知蛋白的含量 191
方案16.2 BCA法测定蛋白质浓度 192
方案16.3 豆类中球蛋白的定量分析 193
方案16.4 心肌、骨骼肌线粒体内膜ATPase的测定 194
方案16.5 荧光分光光度法测定肌肉中乳酸脱氢酶的活性 195
参考文献 196
第17章 蛋白质的分析及应用 197
17.1 质谱技术在蛋白质分析中的应用 197
17.2 核磁共振法在蛋白质分析中的应用 197
17.3 X射线晶体学相关的蛋白质纯化 198
方案17.1 白眉蝮蛇蛇毒精氨酸酯酶分离提纯及分子量的质谱测定 198
方案17.2 肿瘤差异蛋白质的质谱定性 198
方案17.3 果蝇蛋白质磷酸化的质谱分析 200
方案17.4 核磁共振法研究细胞色素空间结构 202
方案17.5 以X射线衍射为目的的SARS-COV Mprc蛋白的分离纯化 202
参考文献 203