1. 绪论 1
1.1 分子生物学与基因工程一瞥 1
1.1.1 Watson和Crick的DNA模板学说 1
1.1.2 Monod和Jacob的操纵子学说 4
1.1.3 基因工程的工具酶和载体 6
1.1.4 基因工程的基本程序 7
1.2 基因工程与分子生物学进展一览 8
1.2.1 基因工程的研究成就 8
1.2.2 分子生物学的研究成就 20
1.3.1 蛋白质工程、改造基因、改造蛋白质、改造生命 25
1.3 基因工程与分子生物学的发展趋势及展望 26
1.3.2 分子生物电子学的兴起，以及不同学科的相互渗透 26
1.3.3 走向海洋，走向宇宙空间 27
1.3.4 大规模深入研究的重大战略部署的出现 29
1.4 不结束语 30
2. 分子生物学实验室常规仪器设备 33
2.1 实验室的基本要求 33
2.2.1 温度控制系统 34
2.2 实验室的常规仪器及设施 34
2.2.2 水的净化装置 35
2.2.3 消毒设备 35
2.2.4 计量系统 35
2.2.5 其它设备 36
2.3 离心机室的装备 37
2.4 分析仪器室的设置 38
2.4.1 电泳装置 38
2.4.2 层析装置 40
2.4.6 DNA合成仪 42
2.4.3 光密度仪 42
2.4.4 真空印迹系统 42
2.4.7 DNA测定仪 43
2.4.8 PCR仪 44
2.5 核素实验室 44
2.5.1 放射性核素操作实验室 45
2.5.2 放射性核素测定室 45
2.6 细胞培养室 45
2.6.1 无菌操作设施 46
2.6.3 观察和研究室 47
2.6.2 温育和贮存区 47
2.6.4 清洗和消毒 48
2.7 暗室 48
2.8 冷室 49
3. 分子生物学实验室常用技术 50
3.1 核酸的纯化 50
3.1.1 酚/氯仿抽提核酸溶液的制备 50
3.1.2 酚的重蒸馏与水饱和 51
3.2.1 固体聚乙二醇吸水浓缩法 52
3.2 核酸的浓缩 52
3.2.2 丁醇抽提浓缩法 53
3.3 核酸的沉淀 53
3.3.1 核酸沉淀的盐类及浓度 53
3.3.2 核酸沉淀的温度与时间 54
3.3.3 离心力与时间 55
3.3.4 有机沉淀剂 55
3.3.5 核酸沉淀的操作方法 56
3.4 核酸的定量 58
3.4.2 荧光分光光度法测定核酸浓度 59
3.4.1 分光光度法测定核酸的浓度 59
3.5 核酸的贮存 60
3.6 限制性内切酶及其应用 61
3.6.1 限制性内切酶的功能、分类及命名 61
3.6.2 限制性内切酶的数量单位及质量控制 62
3.6.3 限制性内切酶酶解体系的建立 63
3.6.4 限制性内切酶酶解中常见的问题和解决措施 65
3.6.5 限制性内切酶的星号活力 67
3.6.6 限制性内切酶的底物位点优势效应 68
3.6.7 琼脂糖包埋完整染色体DNA的内切酶酶解 69
3.6.9 限制性内切酶位点上的甲基化 70
3.6.8 限制性内切酶对单链DNA的切割 70
3.7 电泳 71
3.7.1 原理 71
3.7.2 影响电泳动率的四大因素 72
3.7.3 核酸电泳的指示剂与染色剂 74
3.7.4 电泳装置 77
3.7.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 77
3.7.6 琼脂糖凝胶电泳 80
3.7.7 脉冲场凝胶电泳 84
3.8 超速离心分离技术 87
3.8.1 离心分离物质的原理 87
3.8.2 超速离心的分类 88
3.7.8 双相电泳 88
3.8.3 超速离心在核糖分离中的应用 89
3.9 柱层析 90
3.9.1 排阻层析 91
3.9.2 亲和层析 92
3.9.3 羟基磷灰石柱层析 93
3.9.4 离子交换层析 93
3.9.5 反相层析 93
4.1 核酸分离提取的原则 95
4. 核酸的分离与纯化 95
4.2 真核细胞染色体DNA的制备 96
4.3 质粒和噬菌体DNA的提取与纯化 105
4.3.1 质粒DNA的提取与纯化 105
4.3.2 质粒DAN的小量制备 107
4.3.3 质粒DNA的大量制备 111
4.3.4 质粒DNA的纯化 113
4.3.5 噬菌体DNA的提取与纯化 118
4.4.2 DEAE纤维素纸插片电泳法 124
4.4.1 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的原则 124
4.4 DNA片段的分离及纯化 124
4.4.3 电泳洗脱法 126
4.4.4 低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法 131
4.4.5 玻璃粉末洗脱DNA 131
4.4.6 琼脂糖凝胶中回收DNA片断的纯化 132
4.4.7 聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段 133
4.4.8 蔗糖梯度超速离心分离DNA片段 134
4.5 RNA的分离与纯化(真核细胞RNA的制备 135
4.5.1 创造一个无RNase的环境 136
4.5.2 RNA提取的方法 139
4.5.3 mRNA的分离与纯化 149
5. 核酸分子探针的标记 155
5.1 概述 155
5.1.1 探针的种类及其选择 155
5.1.2 各种标记物及其选择 159
5.1.3 放射性核素的探测 162
5.1.4 放射性核素的卫生防护 162
5.1.5 各种标记方法及其选择 163
5.2 探针的放射性核素标记法 163
5.2.1 切口平移法 163
5.2.2 随机引物法 167
5.2.3 单链DNA探针的标记 170
5.2.4 cDNA探针的标记 172
5.2.5 RNA探针的制备与标记 175
5.2.6 DNA探针的末端标记 178
5.2.7 寡核苷酸探针的标记 187
5.2.8 碘放射性核素标记法 188
5.3 非放射性标记法 189
5.3.1 酶促标记法 189
5.3.2 化学标记法 189
5.4.1 凝胶过滤柱层析法 194
5.4 探针的纯化 194
5.4.2 反相柱层析法 195
5.4.3 乙醇沉淀法 196
5.5 探针比放射活性的测定 196
5.5.1 三氯乙酸沉淀法 196
5.5.2 DE-81滤膜吸附法 197
6. 核酸分子杂交 198
6.1 膜上印迹杂交 198
6.1.1 印迹技术 198
6.1.2 固-液相杂交技术 211
6.1.3 杂交信号的检测 218
6.1.4 滤膜的重复使用 222
6.2 液相杂交技术 222
6.2.1 核酸酶S1保护分析法 222
6.2.2 RNA酶保护分析法 224
6.3 核酸原位杂交及其应用 225
6.3.1 核酸原位杂交的基本原理 225
6.3.2 核酸原位杂交的基本操作方法 229
6.4.1 亲和捕捉法 236
6.4 新技术简介 236
6.4.2 夹心杂交法 237
6.4.3 链取代法 238
7. 基因克隆 239
7.1 基因工程诞生的历史背景 239
7.2 基因克隆的策略与技术路线 240
7.2.1 通过建立基因库分离靶基因 240
7.2.2 通过载体在适当宿主中扩增 240
7.3 目的基因的来源与产生 241
7.4 克隆的载体 242
7.4.1 质粒载体 242
10.2 末端终止法测定DNA核苷酸序列 243
7.4.2 λ噬菌体载体 248
7.4.3 粘粒 252
7.4.4 丝状噬菌体载体 256
7.4.5 真核细胞的克隆载体 258
7.5 DNA分子的体外连接 264
7.5.1 DNA连接酶及连接机制 264
7.5.2 DNA浓度对连接产物构型的影响 267
7.5.3 DNA分子连接的策略与方案 270
7.5.4 一种快速DNA连接技术 286
7.6 重组子导入受体细胞 287
7.6.1 概述 287
7.6.2 转化方法 288
7.7 重组子的筛选与鉴定 292
7.7.1 针对遗传表型改变筛选方法 293
7.7.2 分析重组子结构特征的筛选法 294
7.8 亚克隆技术 298
8. 基因组文库 303
8.1 构建基因组文库的载体 303
8.2 λ噬菌体载体 304
8.2.1 应用λ噬菌体构建基因文库的基本步骤 304
8.2.2 几种λ噬菌体载体 305
8.3 载体DNA的制备 310
8.3.1 载体DNA的酶解 310
8.3.2 酶切后载体的再连接及包装后的滴度检测 312
8.3.3 载体臂的纯化 312
8.3.4 载体的脱磷处理 314
8.3.5 Lamd GEM11/Lamda GEM12 BamHI.Xhol酶切后载体臂的部分填充 314
8.4 真核细胞DNA的制备 315
8.4.1 几种染色体DNA的提取法方 315
8.4.2 限制性内切酶部分酶解高分子量真核DNA 318
8.5 连接和包装 320
8.5.1 连接浓度 320
8.5.2 连接条件的确定 322
8.5.3 包装抽提物的制备和体外包装 323
8.6 基因组文库的保存和扩增 327
8.7 粘性质粒为载体的基因文库 328
9.1.1 mRNA的分离 330
9.1 概述 330
9. cDNA文库 330
9.1.2 cDNA第一链的合成 331
9.1.3 cDNA第二链的合成 331
9.1.4 cDNA与载体连接 332
9.1.5 噬菌体的包装，转染及质粒DNA的转化 334
9.2 cDNA库的构建 335
9.2.1 mRNA分离 335
9.2.2 第一链的合成 335
9.2.3 第二链的合成 336
9.2.5 cDNA与连接子的连接 337
9.2.6 cDNA的分部分离 337
9.2.8 计算克隆的效率 338
9.2.4 cDNA的甲基化 338
9.2.7 cDNA的克隆 338
9.2.9 cDNA库的扩增 339
10. DNA序列测定 340
10.1 概述 340
10.1.1 末端终止法 340
10.1.2 化学裂解法 341
10.2.1 末端终止法测定DNA序列所需的关键试剂 343
10.2.2 末端终止法测定DNA序列方法的选择 344
10.2.3 大片段待测DNA片段的定向连续次级克隆 344
10.2.4 用噬菌体M13克隆待测DAN片段 349
10.2.5 双脱氧末端终止法 352
10.2.6 变性聚丙烯酰胺凝胶制备 355
10.2.7 测序产物的凝胶电泳 356
10.2.8 Taq DNA聚合酶催化的测序反应及凝胶的银染色法 357
10.3 Maxam-Gilbert化学法测定DNA序列 360
10.3.1 待测DNA的纯化 360
10.3.2 碱基的特异性修饰及裂解 361
10.3.3 测序图谱的识读 364
11 外源基因在原核细胞中的表达 365
11.1 原核生物基因表达的特点 365
11.2 外源基因在原核细胞中表达的重要调控元件 366
11.2.1 启动子 366
11.2.2 SD顺序 369
11.2.3 终止子 370
11.3.1 非融合型表达蛋白载体pKK223-3 371
11.3 几种类型的原核表达载体 371
11.3.2 分泌型克隆表达载体PINⅡ系统 372
11.3.3 融合蛋白表达载体pG-EX系统 373
11.4 用于原核细胞表达的外源基因 374
11.5 提高外源基因表达的措施 374
11.5.1 提高翻译水平 374
11.5.2 减轻细胞的代谢负荷，提高外源基因的表达水平 375
11.5.3 提高表达蛋白的稳定性、防止其降解 376
11.6 关于包含体 377
11.7 有关的实验 378
11.7.1 外源基因的诱导表达 379
11.7.2 细菌的裂解 379
11.7.3 包含体的分离 380
11.8 蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 381
11.9 表达产物的免疫学及生物活性检测 387
12. 外源基因在真核细胞中的表达 389
12.1 哺乳动物基因转移的遗传选择标记 389
12.1.1 胸苷激酶基因(tk)选择系统 389
12.1.2 二氢叶酸还原酶基因(dhfr)选择系统 390
12.1.3 新霉素抗性选择系统 390
12.1.4 氯毒素乙酰转移酶基因检测系统 390
12.2 外源基因导入哺乳动物细胞的载体 390
12.2.1 SV40载体 391
12.2.2 其它病毒载体 392
12.3 外源DNA导入哺乳动物细胞的方法 393
12.3.1 磷酸钙转染技术 394
12.3.2 电穿孔转染技术 396
12.3.3 基因显微注射技术 397
12.3.4 脂质体载体法 397
12.3.5 DEAE-葡聚糖转染技术 398
12.4 基因表达产物的检测 399
12.4.1 免疫荧光抗体法检测表达蛋白 399
12.4.2 免疫沉淀法检测表达蛋白 400
12.4.3 Western印迹检测表达蛋白质 403
13. 多聚酶链式反应(PCR)技术 408
13.1 PCR技术的原理 408
13.2 PCR反应的成分和作用 409
13.2.1 PCR反应的缓冲液 409
13.2.3 PCR反应的酶及其浓度 410
13.2.2 底物浓度 410
13.2.4 引物 411
13.2.5 PCR反应条件的选择 411
13.2.6 PCR反应的产物积累规律 412
13.3 PCR反应的自动化 412
13.4 PCR反应引物设计 412
13.5 耐热DNA多聚酶 413
13.6 PCR反应模板的准备 415
13.7 几种特殊的PCR 417
13.7.1 锚定PCR 417
13.7.2 不对称PCR 417
13.7.4 多重PCR 418
13.7.3 反向PCR 418
13.8 PCR技术的应用 419
13.8.1 遗传性疾病的基因诊断 419
13.7.5 着色互补PCR 419
13.8.2 PCR反应在检测艾滋病中的应用 423
13.8.3 检测癌基因 425
13.8.4 PCR在法医学上的应用 427
13.8.5 PCR技术在分子生物学中的其它应用 429
14. DNA的化学合成 435
14.1 DNA化学合成原理 437
14.2 DNA的合成纯化及鉴定 438
14.2.1 DNA合成仪的操作 438
14.2.4 寡核苷酸片段的鉴定 440
14.2.4 合成产物中DNA含量的测定 440
14.2.2 DNA的切落及去保护 440
14.2.3 寡核苷酸片段的纯化 440
14.3 DNA化学合成的应用 441
14.3.2 DNA合成在基因表达和调控方面的应用 443
14.3.3 合成基因在医学中的应用 443
14.3.1 DNA合成在基因工程和分子生物学研究中的应用 444
15. 真核基因表达调控 445
15.1 真核基因表达调控基本理论 445
15.1.1 真核基因结构功能特点 445
15.1.2 真核基因表达调控的策略 446
15.1.3 转录前的表达调控 446
15.1.4 转录水平的调控 450
15.1.5 转录后水平的调控 462
15.1.6 翻译水平的调控 464
15.1.7 翻译后水平的调控 465
15.2 基因表达调控研究方法 465
15.2.1 DNase I超敏感性分析 465
15.2.2 DNA甲基化分析 466
15.2.3 转录起始位点的测定 468
15.2.4 体外转录 470
15.2.5 进行中的核转录分析 472
15.2.6 差示文库 473
15.2.7 氯毒素乙酰转移酶分析 475
15.2.8 凝胶滞留法 479
15.2.9 滤膜结合法 483
15.2.10 Southwestern印迹 485
15.2.11 足纹法 490
15.2.12 蛋白--核酸紫外交联法 509
15.2.13 DNA结合蛋白的分离纯化 511
15.2.14 编码DNA结合蛋白的cDNA克隆的筛选 513
16 转基因动物 518
16.1 转基因方法 518
16.2 微注射DNA的制备与纯化 520
16.2.1 DNA影响基因转移的因素 520
16.2.2 显微注射DNA样品的制备 520
16.3 鼠的种类与饲养 521
16.3.1 鼠的种类 521
16.3.2 鼠的安置与饲养 522
16.4.1 超排卵 523
16.4.2 取卵 523
16.4 超排卵与取卵 523
16.5 显微注射 525
16.5.1 制备持卵管与注射针 525
16.5.2 显微注射操作 527
16.6 卵的转移 529
16.6.1 输卵管转移 529
16.6.2 子宫转移 531
16.7.2 从胎鼠肌肉或幼鼠尾巴提取大分子量DNA 532
16.7.3 转基因鼠中外源DAN的分析 532
16.7.1 取鼠胚胎 532
16.7 转基因鼠系的建立 532
16.7.4 转基因鼠系 533
16.8 卵培养液的配制与保存 533
16.8.1 配制M2与M16的培养液的贮存液 533
16.8.2 由贮存液配制M2 534
16.9 转基因动物的应用 535
16.9.1 基因表达调控 535
16.8.3 由贮存液配制M16 536
16.9.2 转基因动物模型 539
16.9.3 用转基因动物生产生物活性物质与药物 540
17. 人类基因治疗 542
17.1 基因治疗概述 542
17.2.1 反转录病毒 543
17.2 基因转移系统 543
17.2.2 腺病毒 545
17.2.3 腺病毒伴随病毒 545
17.2.4 单纯疱疹病毒 546
17.2.5 脂质体 546
17.2.6 受体介导的蛋白 546
17.3 受体细胞与转移基因的表达 547
17.3.1 造血细胞 547
17.3.2 肌肉细胞 548
17.3.3 成纤维细胞 548
17.3.4 肝细胞 548
17.4 人类基因治疗的审批程序 549
17.3.5 其他细胞 549
17.5 基因标记与基因治疗 550
17.6 遗传病基因治疗 551
17.6.1 腺苷脱氨酶缺陷 552
17.6.2 血友病 553
17.7 肿瘤基因治疗 553
17.8 临床基因治疗概览 554
17.9 伦理学安全性与社会效应 556
17.10 问题与展望 557
附录 560
1. 常用限制性内切酶酶切位点 560
2. 放射性核素数据 563
3. 离心机转速与离心力的换算 564
4. 核酸及蛋白质数据 565
5.1 常用缓冲液的pKa值 571
5. 分子克隆中使用的试剂与常用缓冲液的配制 571
5.2 各种pH值的Tris缓冲液的配制 572
5.3 常见的市售酸碱的浓度 573
5.4 各种浓度的酸碱贮存液的近似pH值 573
5.5 分子克隆常用缓冲液 574
5.6 磷酸缓冲液 574
5.7. 电泳缓冲液 575
6. 常用贮存液的配制 578
7.2 蛋白水解酶 585
7.4 无RNA酶的DAN酶 585
7.3 无DNA酶的RNA酶 585
7.1 溶菌酶 585
7. 常用酶的配制 585
8. 常用层析数据 587
9. 细菌培养基、抗生素和菌株 590
9.1 液体培养基 590
9.2 含有琼脂或琼脂糖的培养基 592
9.3 保存培养基 593
9.4 抗生素 594
9.5 用于λ噬菌体操作的溶液 594
9.6 细菌菌株一览表 595
9.7 常见大肠杆菌菌株遗传标记 603
英汉分子生物学词汇 605
索引 650