第一章 质粒的制备 1
第一节 细菌的培养和保存 1
一、培养基的制备 1
二、液体细菌培养 2
三、固体细菌培养 2
四、菌种的保存与复苏 2
第二节 细菌感受态的制备和质粒的转化 2
一、感受态细胞的制备 3
二、细菌的转化 3
第三节 质粒的提取和纯化 3
一、质粒的小量提取 3
二、质粒的大量提取(碱裂解法) 5
第二章 DNA的限制性内切酶酶切技术 7
第一节 限制性内切酶的特性和反应条件 7
一、限制性内切酶的来源 7
二、限制性内切酶的命名 7
三、分类 7
四、限制酶的特性 8
五、酶活力单位的定义及酶的贮存 8
六、限制酶的反应条件 8
第二节 限制性内切酶的应用方法 11
一、小量酶解反应 12
二、大量酶解反应 12
三、双酶解反应 12
四、酶解产物的鉴定 13
第三章 DNA重组体的构建 15
第一节 DNA重组的方法 15
一、粘端连接法 15
二、平端连接法 17
三、平-粘连接法 18
第二节 DNA重组反应 19
一、粘端连接反应方法 19
二、平端连接反应方法 19
三、定向连接反应 19
第三节 重组质粒的鉴定 20
一、α互补 20
二、插入失活 21
三、菌落原位杂交 21
四、限制酶酶切分析 22
第四章 DNA序列测定 24
第一节 Sanger双脱氧链终止法的原理及试剂 24
一、原理 24
二、试剂 24
第三节 聚丙烯酰胺测序凝胶的制备 25
一、测序板的处理与安装 25
二、测序凝胶的灌制 26
第三节 测序样品的制备反应与高压电泳 26
一、应用T7测序试剂盒的测序反应方法 26
二、引物末端标记法 27
第四节 测序凝胶的放射自显影与序列的读取 28
一、放射自显影 28
二、DNA序列的读取 28
第五章 核酸探针的制备和标记 30
第一节 核酸探针的基本概念和种类 30
一、基本概念 30
二、探针的种类及选择 30
三、各类标记物及选择 30
第二节 DNA探针的制备和标记 31
一、切口平移法 31
二、随机引物法 32
三、单链DNA探针的制备和标记 34
四、DNA探针的末端标记 36
第三节 RNA探针的制备和标记 40
一、SP6/T7RNA聚合酶体外转录的原理 40
二、RNA探针制备方法 41
第四节 寡核苷酸探针的制备和标记 42
第五节 探针的纯化和比放射性活性测定 42
一、探针的纯化 42
二、探针的比放射性活性测定 44
第六节 非同位素法标记核酸探针 44
一、地高辛标记法 45
二、光敏生物素法 46
第六章 DNA的凝胶电泳 47
第一节 琼脂糖凝胶电泳 47
一、琼脂糖凝胶的性质 47
二、电泳装置 48
三、电泳缓冲液 48
四、凝胶浓度的选择 48
五、常规琼脂糖凝胶电泳 48
六、碱性琼脂糖凝胶电泳 49
第二节 聚丙烯酰胺凝胶DNA电泳 50
一、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 50
二、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 52
第三节 从凝胶中回收和纯化DNA 53
一、DNA的回收 53
二、回收DNA的纯化(DEAE-sephacel柱层析法) 54
第七章 真核细胞总RNA的制备与分析 56
第一节 RNA的制备 56
一、培养细胞总RNA制备 57
二、组织RNA的制备(并硫氰酰胍法) 59
三、Poly(A)+RNA的纯化(寡聚(dT)纤维素纯化mRNA 59
四、分级分离RNA 60
第二节 RNA的分析 62
一、Northern Blot杂交 62
二、RNA的狭线杂交 63
第八章 细胞及组织DNA的制备和Southern Blot分析 65
第一节 真核基因组DNA的制备 65
一、细胞基因组DNA的提取 65
二、组织细胞基因组DNA的提取 66
三、DNA的纯化、定量和浓缩 67
第二节 DNA印迹转移杂交技术 70
一、琼脂糖凝胶电泳分离基因组DNA限制性酶切片段 70
二、DNA的转移与固定 71
三、预杂交和杂交 77
第三节 放射自显影和显色反应 78
一、放射自显影 78
二、非同位素探针杂交的检测 79
第九章 克隆化基因的表达与蛋白产物的检测 84
第一节 原核表达系统的理论基础 84
一、原核细胞的分子生物学特点及表达调控因素 84
二、外源基因的克隆与重组 85
三、外源基因的蛋白表达方式 85
第二节 克隆化基因产物的检测与分析 86
一、外源基因的诱导表达 86
二、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化 86
三、蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 88
四、Western印迹法检测表达蛋白 92
第十章 生长因子的常用检测方法 95
第一节 生长因子的定性检测 95
第二节 生长因子的定量检测 96
一、免疫沉淀法检测表达蛋白 96
二、ELISA法 98
第三节 生长因子活性检测 100
一、3H-TdR掺入法 101
二、MTT比色法 101
第十一章 聚合酶链反应技术 103
第一节 PCR的原理与基本操作 103
一、PCR的原理 103
二、基本操作 103
第二节 PCR反应体系中的各种组分 104
一、引物 104
二、DNA聚合酶 106
三、PCR反应缓冲液 106
四、dNTRs 107
第三节 PCR反应模板的制备 107
一、细菌DNA的制备 107
二、全血标本DNA制备 107
三、从白细胞中制备DNA 108
四、临床拭子标本DNA的提取 110
五、固定和包埋的组织标本DNA提取 111
六、绒毛及羊水细胞DNA的提取 112
七、由微量及特殊标本中制备染色体DNA 112
八、DNA标本的制备 112
第四节 PCR反应条件的优化 113
一、温度循环参数 113
二、PCR产物积累规律 114
三、手工操作和自动化 114
四、预防假阳性结果 114
第五节 PCR扩增产物的分析 115
一、凝胶电泳分析法 115
二、点杂交 116
三、微孔板杂交法 118
四、PCR-ELISA法 119
第六节 PCR相关技术及其应用 119
一、PCR引物的5’端修饰 119
二、应用PCR制备探针 122
三、PCR克隆 123
四、原位PCR 124
五、逆转录PCR 125
六、其它几种PCR相关技术 126
第十二章 原位杂产技术 128
第一节 原位杂交技术基础程序 128
一、玻片的预处理 128
二、组织取材与固定剂的选择 130
三、组织切片的处理 130
四、杂交反应 131
五、杂交后处理 133
六、杂交体的检测 134
七、对照实验和ISHH结果的判断 135
八、原位杂交基本操作步骤 137
第二节 组织细胞原位杂交技术 137
一、细胞和组织片制作 137
二、预杂交和杂交 138
三、杂交后处理 138
四、显示系统 139
第三节 染色体原位杂交技术 141
一、染色体的制备 141
二、原位杂交 142
三、信号检测 142
四、显带复制 142
第四节 原位杂交结合免疫组织化学技术 143
一、同位素原位杂交与免疫组化PAP法联合程序 143
二、非同位素原位杂交与免疫组化联合法 143
第五节 双重标记原位杂交技术 145
一、两种同位素标记探针的双重标记原位杂交 145
二、结合放射性同位素和非放射性标记探针的双重标记原位杂交 145
三、非放射性标记探针的双重标记原位杂交 146
第六节 电镜原位杂交技术 147
第七节 PCR与原位杂交细胞化学结合法 149
第八节 原位引物延伸标记法 150
第十三章 真核细胞基因转染技术 152
第一节 细胞培养基本技术 152
一、培养基制备 152
二、细胞冻存 153
三、细胞复苏 153
第二节 细胞转染方法 153
一、转染质粒的制备 153
二、磷酸钙介导转染法 154
三、DEAE葡聚糖介导转染法 155
四、电击基因导入法 156
五、脂质体介导转染法 157
第三节 转染细胞的筛选 159
一、G418筛选 160
二、克隆细胞株的转移与扩增 161
第十四章 重组逆转录病毒的包装与克隆筛选 163
第一节 重组逆转录病毒的包装 163
一、包装细胞的来源与特性 163
二、目的基因的导入与包装 164
三、重组逆转录病毒液的制备 164
四、病毒液的浓缩与保存 165
第二节 病毒滴度的测定 165
一、NIH3T3细胞的培养与准备 165
二、病毒滴度测定与计算 165
第三节 野生型病毒的检测 166
一、PCR检测 166
二、PT-PCR检测 166
三、S+/L-检测法 166
四、neo基因及β-半乳糖苷酪(β-gal)互补分析法 166
第四节 逆转录病毒介导的体外基因转移方法 167
一、靶细胞的选择条件 167
二、常用靶细胞 167
三、肿瘤浸润淋巴细胞的分离和培养 168
四、病毒感染靶细胞 168
第十五章 程序化细胞死亡常用研究方法 170
第一节 基本概念 170
一、PCD的形态学特征 170
二、PCD的生化特性 171
第二节 形态学观察方法 172
一、普通光镜观察方法 172
二、活细胞悬液荧光染色法 174
三、透射电镜观察法 175
附：超薄切片常规光镜观察制备方法 175
第三节 琼脂糖凝胶电泳法 176
一、常规法 176
二、快速法 177
第四节 流式细胞仪观察法 177
一、PI染色法 177
二、Hoechst-PI染色方法 179
第五节 末端标记法 180
一、简易末端标记法 180
二、5’末端32P标记法 181
三、原位末端标记法 182
第十六章 分子生物学实验室常用仪器的使用方法与保养 184
第一节 PCR扩增仪 184
第二节 冷冻离心机 185
第三节 紫外检测仪 185
第四节 数字式酸度计 186
第五节 分光光度计 187
第六节 电泳仪 188
第七节 分析天平 189
附录一 常用实验用品的处理 191
附录二 常用缓冲液和储存液的浓度及配制方法 191
附录三 常用试剂的配制 194
附录四 常用单位的换算 195
附录五 常用的同位素及标记化合物 196
附录六 放射性自显影试剂、器材及检测 199
附录七 国内主要生物技术公司及试验仪器生产厂家 200