第一部分 生物化学技术基本理论 3
第一章 分光光度技术 3
第一节 基本原理 3
一、光的基本知识 3
二、朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律 3
第二节 分光光度计结构简介 5
一、光源 6
二、分光系统(单色器) 6
三、狭缝 6
四、比色环 6
五、检测系统 6
二、用紫外光谱鉴定化合物 7
一、测定溶液中物质的含量 7
第三节 分光光度技术的应用 7
第四节 分光光度法的误差 8
第五节 常见国产分光光度计的使用 8
一、721型分光光度计 8
二、751型分光光度计 9
三、使用分光光度计的注意事项 10
第二章 液相色谱技术 12
第一节 色谱原理及基本装置 13
第二节 凝胶色谱 14
一、原理 14
二、凝胶的种类 15
三、凝胶色谱使用方法 18
第一节 序列测定的技术和策略 19
四、应用 19
二、离子交换剂的类型 20
第三节 离子交换色谱法 20
一、基本原理 20
三、IEC的方法 22
第四节 亲和色谱 23
一、固相载体的选择 24
二、配体的选择 24
三、配体与载体之间的偶联 24
四、使用方法 25
第五节 高效液相色谱法 26
一、高效液相色谱仪 27
二、HPLC的应用及进展 28
第三章 电泳技术 32
第一节 基本原理 33
第二节 醋酸纤维薄膜电泳 35
第三节 琼脂糖凝胶电泳 36
第四节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 37
第五节 等电聚焦 39
第六节 电泳后大分子的检测 40
第四章 离心技术 43
第一节 基本原理 43
一、重力场中的沉降 43
二、相对离心力 44
三、沉降速度 45
四、沉降系数 46
第二节 离心机的构造 47
五、沉降时间 47
一、离心室 48
二、驱动系统 48
三、冷冻系统 48
四、真空系统 48
五、操作系统 48
第三节 离心转头和离心管 48
一、角度转头 49
二、甩平转头 49
三、垂直转头 49
四、区带转头 49
八、离心管 50
七、离心转头的常用标记及转头参数 50
六、其他转头 50
五、连续流动转头 50
第四节 各型离心机的性能及适用范围 51
一、低速离心机 51
二、高速离心机 52
三、超速离心机 53
第五节 离心方法 53
一、差速沉淀离心 53
二、速度区带离心 54
三、等密度离心 57
四、分析性离心 58
五、离心操作要领 59
一、放射性同位素的特点 60
第一节 放射性同位素的性质 60
第五章 放射性同位素技术 60
第二节 放射性同位素示踪 61
一、同位素示踪的基本原理 61
二、放射性强度及其度量单位 61
二、放射性同位素示踪实验具体步骤 62
三、几种常用的放射性同位素示踪法 67
第三节 放射性测量 68
一、闪烁计数器的工作原理 68
二、晶体闪烁计数 69
三、液体闪烁计数 70
四、放射测量的注意事项 74
一、放射性的危害性及防护的必要性 75
第四节 放射防护 75
二、放射防护的三原则 76
三、内照射和外照射的防护 76
四、放射性污染的清除 80
五、合理处理放射性同位素三废 82
第六章 发光分析技术 85
第一节 分子荧光分析技术 85
一、荧光的产生 85
二、荧光检测的类型 86
三、荧光分析的基本参数 87
四、环境因素对荧光分析的影响 89
五、荧光定量测定的方法 90
六、荧光分析仪器的基本结构 90
七、几种不同类型的荧光分析测定装置 91
第二节 化学发光分析 93
一、化学发光的一般机制 93
二、化学发光定量分析的原理 94
三、常用的化学发光物质及反应系统 96
四、化学发光的测定 97
五、化学发光的应用 97
第七章 生物大分子制备技术 99
第一节 选择材料及预防处理 99
第二节 细胞的破碎及细胞器的分离 100
一、细胞的破碎 100
二、细胞器的分离 100
第三节 提取和纯化 101
一、蛋白质(包括酶)的提取 101
二、蛋白质的分离纯化 102
三、核酸的提取 103
四、核酸的纯化 104
五、核酸的浓缩 104
六、DNA、RNA的定量 105
七、核酸的凝胶电泳和相对分子质量参照物 105
第四节 浓缩、干燥及保存 107
一、样品的浓缩 107
二、干燥 108
三、保存 108
第二部分 分子生物学技术基本理论 113
第八章 DNA重组技术 113
第一节 目的基因的获取 114
一、直接从染色体中分离 114
二、化学合成法 114
三、用逆转录酶合成cDNA 114
四、构建和筛选基因组文库及cDNA文库 114
五、聚合酶链反应 115
第二节 分子克隆载体与宿主的选择 116
一、质粒载体 116
二、噬菌体 118
三、噬菌粒 118
四、粘粒 119
五、宿主细胞 119
第三节 分子克隆常用的工具酶 119
一、限制性核酸内切酶 120
二、DNA聚合酶 122
三、DNA连接酶 123
四、末端脱氧核苷酸转移酶 123
五、核酸酶 123
七、碱性磷酸酶 123
六、脱氧核糖核酸酶 123
第四节 DNA限制性内切酶酶切及片段回收 124
一、限制性内切酶运用的设计 124
二、限制性内切酶的酶切 124
三、琼脂糖凝胶电泳分离DNA和DNA片段的回收 125
四、琼脂糖凝胶中回收DNA片段的纯化 128
第五节 外源基因与载体的连接 129
一、粘性末端连接 129
二、平末端的连接 130
三、DNA的胶内连接 130
第六节 重组DNA导入宿主细胞 131
一、大肠杆菌的转化 131
二、电脉冲穿孔法转化大肠杆菌 132
第七节 含重组质粒的宿主菌落的筛选与鉴定 133
一、利用宿主细胞遗传表型的改变进行筛选 133
二、分析重组子分子结构特性进行鉴定 134
第九章 重组DNA表达技术 136
第一节 大肠杆菌表达系统 136
一、E.coli表达载体的结构 136
二、常用的大肠杆菌表达载体 137
三、表达中的其他问题 142
第二节 哺乳动物细胞表达系统 143
一、真核表达载体 143
二、外源DNA 147
三、宿主细胞 147
四、重组载体导入哺乳动物细胞 147
五、基因表达产物的检测 148
一、DNA变性 149
第十章 分子杂交技术 149
第一节 核酸杂交的基本理论--DNA的变性与复性 149
二、DNA复性 150
三、核酸分子杂交 151
第二节 核酸探针及其标记物 151
一、核酸探针的种类及应用 151
二、标记物的应用及选择 153
第三节 放射性同位素标记核酸探针 154
一、切口平移法(nick translation) 154
四、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段快速标记DNA探针末端 155
三、用T4多核苷酸激酶标记DNA5 末端 155
二、随机引物法(random primer) 155
第四节 非放射性物质标记核酸探针 156
一、生物素(biotin)标记核酸探针 156
二、地高辛标记核酸探针 156
第五节 核酸分子杂交方法 158
一、核酸分子杂交的类型 158
二、核酸分子杂交实验因素的优化 163
第六节 蛋白质分子杂交 167
四、免疫沉淀 168
二、Southern Western印迹 168
三、Western Blotting 168
一、凝胶滞留法(gel retardation assay) 168
第十一章 cDNA文库的构建与筛选 170
第一节 概述：cDNA文库概念 170
第二节 cDNA文库构建的策略 171
一、mRNA的制备 171
二、cDNA的制备 173
三、载体的选择 174
四、连接与转化 175
五、库容量 175
第三节 cDNA文库的筛选 176
第一节 PCR基本原理和影响因素 179
一、基本原理 179
二、PCR各步骤简介 179
第十二章 聚合酶链反应(PCR)技术 179
三、材料 180
四、方法 181
五、注意事项 181
六、PCR条件优化 183
三、方法 184
第二节 逆转录PCR技术 184
二、材料 184
一、原理 184
四、注意事项 185
第三节 PCR-SSCP银染技术 185
一、原理 186
二、材料 186
三、方法 186
四、注意事项 187
第四节 PCR衍生技术介绍 188
一、重组PCR(recombinant PCR,RPCR) 188
二、原位PCR(in situ PCR) 188
三、固着PCR(sanchorde PCR,SA-PCR) 188
四、不对称PCR(asymmetric PCR) 189
五、锚定PCR(anchored PCR) 189
六、反向PCR(inverse PCR) 189
一、分子生物学科研领域 190
第五节 PCR技术的应用 190
八、多重PCR(multiplex PCR) 190
七、着色互补 PCR(color complementation PCR) 190
二、临床医学领域 191
三、动植物学的研究 192
四、其他领域 192
第十三章 DNA序列测定技术 194
一、双脱氧链终止法 194
二、DNA化学降解法 197
三、测序策略 198
第二节 Sanger双脱氧链终止法测序 199
一、测序反应 199
二、变性聚丙稀酰胺凝胶 200
三、应用大肠杆菌DNA聚合酶 I Klenow片段进行的双脱氧测序反应 205
第三节 全自动激光荧光DNA测序 207
第十四章 蛋白质分子结构测定技术 209
第一节 蛋白质一级结构的测定 210
一、蛋白质或肽的氨基酸组成的定量测定 211
二、蛋白质或肽的末端测定 212
三、亚基拆离、肽链降解和肽段的分离 216
四、肽段的氨基酸顺序测定 219
五、重叠肽法确定肽链的一级结构 220
六、蛋白质分子中二硫键和酰胺基位置的确定 221
第二节 蛋白质晶体结构分析 222
第三节 质谱技术 231
一、质谱技术简介和原理 231
二、质谱技术在蛋白质、多肽结构测定中的应用 233
第四节 核磁共振技术 234
一、核磁共振确定蛋白质三维结构的基本原理 234
二、蛋白质溶液三维结构的计算 237
第三部分 生物化学与分子生物学教学实验 243
实验一 蛋白质的变性、凝固及沉淀反应 243
实验二 蛋白质含量测定 245
实验三 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量 248
实验四 等电聚焦法测定蛋白质等电点 252
实验五 脲酶Km值简易测定 255
实验六 碱性磷酸酶的分离纯化 257
实验七 血清白蛋白、γ-球蛋白的分离纯化及鉴定 261
实验八 胰凝乳蛋白酶的制备及活力测定 267
实验九 蛋清溶菌酶的分离 269
实验十 组织DNA与RNA的分离和提纯 271
实验十一 核酸的琼脂糖凝胶电泳 273
实验十二 DNA与RNA的定量测定 274
实验十三 RNA的合成及其抑制 277
实验十四 质粒DNA的提取 280
实验十五 聚合酶链反应 283
实验十六 分子杂交实验 284
实验十七 DNA重组实验 289
一、实验室规则 297
二、实验室常识 297
Ⅰ实验须知 297
前言 297
第四部分 附录 297
三、实验室安全 298
四、实验室急救 299
五、移液器的使用及注意事项 299
六、玻璃仪器的清洗及各种溶液的配制 301
七、实验误差与数据处理 302
一、溶液浓度的表示与计算 305
试剂的配制 305
Ⅱ 生物化学与分子生物学常用试剂的配制及参数 305
二、常用缓冲溶液的配制 308
三、体积分数酸、碱溶液的配制 313
四、闪烁液的配方 313
五、硫酸铵饱和度的常见表 314
常用参数 317
一、一些化学试剂的分级 317
二、易变质及需要特殊方法保存的试剂 317
四、常用酸碱体积分数、相对密度和物质的量浓度的关系 318
三、常用酸碱的相对密度和质量分数、物质的量浓度的关系 318
五、一些常用化合物的溶解度(20℃) 320
六、某些有机溶剂的主要物理常数 320
七、冷却剂和干燥剂 321
八、常用蛋白质(酶)的理化特性 322
九、层析法常用资料 327
十、同位素衰减表 330
十一、离心机转速与相对离心力的换算 330
十二、数字词头 331
十三、常用药品中英文对照及分子式、相对分子质量表 331