第一章 大肠杆菌表达系统 1
一、表达载体的构成 1
(一)复制子 1
(二)筛选标记 2
(三)启动子和终止子 3
(四)核糖体结合位点 3
二、各种类型表达系统的构成及特点 4
(一)Lac和Tac表达系统 4
(二)RL和PR表达系统 5
(三)T7表达系统 6
(四)其他表达系统 7
三、目标蛋白表达的形式和在细胞中的位置 8
四、高效表达目标基因的战略和技术 9
(一)表达质粒的优化设计 10
(二)共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因 11
(三)提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性 11
(四)高密度发酵和工程化宿主细胞 13
五、大肠杆菌表达系统研究的发展趋势 14
第二章 芽孢杆菌表达系统 20
一、发展简史 20
二、表达概述 21
(一)特点 21
(二)宿主菌株 21
(三)载体 22
(一)基因表达的特点 25
三、基因表达 25
(二)已表达的克隆基因 26
(三)蛋白质工程 29
四、存在问题及今后发展方向 29
(一)关于表达真核基因方面 29
(二)关于表达酶的方面 30
(三)关于表达杀虫菌晶体蛋白(ICP)方面 30
(四)关于致病菌炭疽芽孢杆菌方面 31
(五)利用芽孢杆菌基因工程技术扩大和加强芽孢杆菌在各方面的应用 31
第三章 链霉菌基因表达系统 39
一、链霉菌的生物学特征 39
(一)链霉菌的载体 40
二、链霉菌基因克隆系统 40
(二)链霉菌基因转移的方法 43
三、链霉菌基因的调控和蛋白质的分泌表达 43
(一)RNA聚合酶基因多样性 43
(二)调节基因 44
(三)调节因子 44
(四)链霉菌基因的转录调控 45
(五)链霉菌中的蛋白外泌系统 46
四、外源基因在链霉菌中的表达 48
(一)同种异源基因的表达 48
(二)异种外源基因的表达 51
(二)信号肽对外源蛋白分泌的影响 52
五、影响链霉菌中基因表达的因素 52
(一)启动子对外源基因表达的影响 52
(三)密码子、SD序列和终止子等对基因表达的影响 54
(四)DNA扩增序列对基因表达的影响 55
(五)发酵条件对外源基因表达的影响 55
六、链霉菌基因表达翻译的后修饰 56
(一)对外源蛋白的糖基化 56
(二)对外源蛋白的降解 56
七、链霉菌作为表达系统的优缺点及研究发展趋势 57
第四章 原核生物增强子样序列 65
一、基因转录调节的两类基本元件 65
(一)启动子元件 65
二、原核基因表达调节的一些见解 66
(二)增强子元件 66
三、来源于动物病毒基因序列和大肠杆菌染色体的大肠杆菌增强子(V-EE和E-EE) 67
四、λPL和trp启动子上游AT丰富区的增强子样效应 68
五、hylR增强子 69
六、固氮基因的原核增强子 69
七、T4噬菌体晚期基因转录增强子 71
八、原核增强子样序列的应用 73
第五章 酵母表达系统 77
一、酵母基因表达系统的概况 77
(一)酵母载体的基本结构 77
(二)酵母表达系统中载体的种类 79
(三)酵母菌基因表达系统的宿主 81
(四)酵母的DNA转化 82
二、酵母表达系统研究进展 83
(一)外源基因在酵母中的高表达 83
(二)提高外源基因表达产物的质量 86
(三)酵母表达系统的新应用 88
三、结束语 91
第六章 丝状真菌基因工程 96
一、载体和转化方法 96
(一)载体 96
(二)转化方法 99
(四)转化DNA的归宿 100
(三)提高转化频率的方法 100
二、基因的结构和功能 101
(一)转录 102
(二)翻译起始和终止 106
(三)密码子利用度 106
(四)基因的染色体排列和定位 106
(五)基因表达的调控 107
三、次级代谢产物的生产 107
(一)β-内酰胺抗生素 107
(二)多肽代谢物 113
四、外源蛋白在真菌中的表达 114
(一)工业用酶 115
(二)医疗用蛋白酶 118
五、展望 119
一、历史回顾 125
第七章 昆虫表达系统 125
二、最新进展 127
(一)重组病毒获得的技术途径及转移载体的发展 127
(二)病毒载体的改进 130
(三)昆虫细胞培养技术和稳定表达系统 131
(四)自主式昆虫宿主反应器 132
(五)杆状病毒在蛋白质结构和功能上的研究 132
(六)昆虫病毒表达系统用于多肽药物和疫苗研制 133
三、今后方向 134
一、概述 139
第八章 哺乳动物细胞表达系统 139
二、哺乳动物细胞表达系统 140
(一)宿主细胞 140
(二)表达载体的构建和常用的细胞表达系统 142
(三)高表达细胞株的基因共扩增和筛选方法 149
三、展望 150
(一)改进表达载体，提高表达水平和产量 150
(二)利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本 152
(三)抑制细胞凋亡，延长培养周期 153
(四)采用“糖基化”工程，提高产品质量 154
(一)转基因动物发展简史 159
一、转基因动物概述 159
第九章 转基因动物与基因表达 159
(二)什么是转基因动物 160
(三)有关转基因动物的伦理学问题 160
二、转基因方法 160
(一)显微注射 161
(二)通过动物体细胞克隆生产转基因动物 162
(三)其他转基因方法 164
三、基因整合 165
(一)随机整合 165
(二)同源重组 168
(一)组织特异性表达 169
四、动物基因表达的基础知识 169
(二)染色质的结构 170
(三)真核基因的表达过程 171
五、外源基因的表达 175
(一)真核基因表达的调控序列 175
(二)表达结构的构建和功能域转移 178
六、转基因动物在生物工程产业中的应用前景 179
(一)提高家畜的生长速度和饲料转化效率 179
(二)生产药用蛋白质 179
(三)人工改良牛奶 180
(四)器官供应来源 180
二、基本原理、方法 184
(一)转化方法 184
第十章 植物生物反应器 184
一、引言 184
(二)转基因的构建 185
三、进展、问题与对策 186
(一)国内外研究、应用进展 186
(二)问题与对策 190
四、总结 194
第十一章 基因治疗中的基因表达问题 196
一、基因治疗概况 196
(一)基因治疗的概念和适应症 196
(二)基因治疗的策略 197
(三)临床项目的现状与评价 197
(一)病毒载体 198
二、基因治疗载体系统的种类和特点 198
(二)非病毒载体 201
(三)基因导人体内新途径 202
三、靶向性问题 203
(一)靶向导入型载体 203
(二)靶向性表达 206
四、基因表达调控问题 207
(一)可诱导表达系统 207
(二)特异反应性启动子诱导表达系统 209
(三)调控序列对基因表达的影响 210
(四)目的基因体内长期表达的问题 211
五、小结与展望 212
一、基因重组菌的稳定性 215
第十二章 基因表达与发酵 215
(一)培养过程中重组菌稳定性对群体组成变化的影响 216
(二)培养条件对稳定性的影响 217
二、影响外源基因表达的因素 221
(一)培养基 221
(二)比生长速率 221
(三)溶氧 223
(四)温度 224
(五)外源基因表达的诱导强度 224
(六)代谢副产物的影响 224
三、发酵过程的优化和控制 225
(一)高密度培养 225
(七)重组菌的稳定性 225
(二)代谢副产物生成的防止 227
(三)发酵过程的控制 230
(四)培养的操作方式 232
(五)展望 233
第十三章 基因表达技术中的序列数据分析方法 237
一、前言 237
二、序列数据分析方法的概述 238
(一)基因工程实验中的模拟 240
(二)PCR的计算机设计方法 241
(三)序列比较方法 248
(四)外源基因表达水平的分析 263
(五)蛋白质性质的分析 267