目录 1
译者序 1
前言 1
编著者名录 1
第一章 聚乙二醇介导的烟草叶肉原生质体的转化：一个研究Cre与lox重组的实验 Michael K．Morgan和David W．Ow 1
1．导论 1
2．原生质体的制备 7
3．聚乙二醇介导的转化 8
4．荧光酶分析 9
5．培养基的配制 10
6．试剂的配制 11
第二章 利用在玉米原生质体内的瞬时表达对一个植物转录因子进行功能分析 Leonard Rosenkrans，Vimla Vasil，Indra K．Vasil和Donald R．McCarty 13
1．导论 13
2．玉米悬浮培养细胞的维持培养 16
3．原生质体的制备 16
4．电击实验 17
5．β-葡糖苷酸酶（GUS）的荧光测定 19
6．培养基的制备 20
7．试剂的配制 22
第三章 用基因枪转化法将抗药基因导入烟草细胞 Pal Maliga 24
1．导论 24
2．待转化烟草XD细胞的制备 30
3．外被DNA钨粉微粒的制备 30
4．用PDS-1000/He型基因枪转化法将DNA导入烟草XD细胞 31
5．β-葡糖苷酸酶（GUS）瞬时表达分析 32
6．抗卡那霉素细胞系的选择 33
7．培养基的制备 34
8．试剂的配制 35
第四章 烟叶盘片和农杆菌pPZP二元载体共培养构建转基因烟草植株 Zora Svab，Peter Hajdukiewicz和Pal Maliga 37
1．导论 37
2．利用三亲杂交将pPZP二元载体导入农杆菌 43
3．烟叶盘片和农杆菌的共培养及抗性芽的鉴定 45
4．β-葡糖醛酸酶（GUS）的组织化学鉴定 47
5．转基因烟草幼苗中具有抗生素抗性表型植株的测试 48
6．培养基的配制 50
7．试剂的配制 52
1．导论 53
第五章 组织印迹法检测植物组织中的蛋白质和RNA Joesph E.Varner和Zheng-Hua Ye 53
2．组织印迹的Western杂交 56
3．组织印迹的Northern杂交 57
4．试剂的配制 59
第六章 固定和包埋植物组织中蛋白质的免疫定位 David C.Dixon和Daniel F.Klessig 62
1．导论 62
2．植物组织的甲醛固定和包埋 66
3．包埋植物组织的切片和封固 68
4．免疫染色 69
5．试剂的配制 71
第七章 用于检测植物组织RNA的原位杂交法 David C.Dixon，John R.Cutt和Daniel F.Klessig 73
1．导论 73
2．组织切片制备 79
3．RNA探针的合成 80
4．组织的预杂交处理 84
5．杂交 85
6．杂交后洗涤 86
7．放射自显影 87
8．染色 88
9．试剂的配制 89
第八章 向离体叶绿体内引入蛋白质 Gayle K.Lamppa 92
1．导论 92
2．体外转录 98
3．在兔网织红细胞裂解液中进行体外翻译 100
4．叶绿体的提取 101
5．叶绿体中蛋白的引入 103
6．引入产物的SDS-PAGE分析 105
7．SDS-聚丙烯酰胺凝胶的放射自显影处理 107
9．完整叶绿体的快速提取 108
8．膜组分和内腔可溶性组分中放射性标记蛋白的量化 108
10．试剂的配制 109
第九章 显微注射与植物顶端组织发育模式的研究 Chris van der Schoot和William J.Lucas 113
1．导论 113
2．组织制备 119
3．显微注射与染料偶联实验 120
4．试剂的配制 122
第十章 叶绿体连缀转录：叶绿体基因转录活性的测定 Xing-Wang Deng和William Gruissem 124
1．导论 124
2．从菠菜中分离完整的叶绿体 127
3．连缀转录 129
4．通过杂交定量连缀转录水平 131
5．试剂的配制 132
第十一章 叶绿体RNA的体外加工与用紫外交联分析RNA-蛋白质的相互作用 Gadi Schuster和Wilhelm Gruissem 136
1．导论 136
2．RNA的合成 140
3．叶绿体mRNA 3′末端的体外加工 142
4．蛋白质与RNA的交联 144
5．试剂的配制 147
1．导论 152
第十二章 与DNA结合蛋白相作用的启动子序列的鉴定 Thianda Manzara和Wilhelm Gruissem 152
2．番茄子叶细胞核的分离提取 158
3．核抽提物的制备 159
4．DNA片段的标记 160
5．迁移率变动分析法 163
6．DNase Ⅰ足迹分析法 165
7．试剂的配制 168
第十三章 测定蛋白质与DNA结合位点的电泳迁移率变动分析法 Ulrike Schindler和Anthony R.Cashmore 172
1．导论 172
2．放射性标记DNA探针的制备 178
3．蛋白质与DNA结合反应 180
4．非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备 181
5．试剂的配制 182
第十四章 甲基化干扰法鉴定与蛋白结合的DNA位点 Ulrike Schindler和Anthony R.Cashmore 185
1．导论 185
2．放射性标记DNA探针的制备 190
3．甲基化反应 190
4．蛋白／DNA结合反应 191
5．放射性标记DNA带的洗脱 193
6．DNA片段的切割和变性PAGE分析 194
7．试剂的配制 196
第十五章 用原位筛选法分离编码序列特异性DNA结合蛋白的cDNA Ulrike Schindler和Anthony R.Cashmore 198
1．导论 198
2．放射性标记DNA探针的制备 204
3．大肠杆菌感受态细胞的制备 204
4．大肠杆菌的感染和蛋白合成的诱导 204
5．变性、复性和封闭 206
6．结合反应 207
7．阳性噬菌斑的鉴定 207
8．第二和第三轮筛选 208
9．培养基的配制 209
10．试剂的配制 210
第十六章 DNA结合蛋白的磷酸化研究 Leszek J.Klimczak和Anthony R.Cashmore 212
1．导论 212
2．磷酸化化学计量的确定及磷蛋白形成动力学的测定 216
3．用放射性标记的磷蛋白和非标记的DNA探针进行迁移率变动分析：磷酸化 219
蛋白与DNA的结合 219
4．用非标记的磷蛋白和放射性标记的DNA探针进行迁移率变动分析：磷酸化蛋白与DNA的结合 220
5．生化计算举例 223
6．试剂的配制 224
第十七章 用连接介导PCR进行体内基因组足迹分析：比较在黑暗和光照条件下生长的番茄幼苗的RbcS3B启动子活性 Pedro Carrasco和Wilhelm Gruissem 227
1．导论 227
2．番茄幼苗子叶的DMS处理 232
3．基因组DNA的小量制备……………………………………………………（232) 234
4．基因组DNA的体外甲基化 234
5．用哌啶进行甲基化DNA的化学裂解………………………………………（235) 236
6．第一链的合成………………………………………………………………（235) 236
7．接头-引物连接反应 236
8．PCR扩增 237
9．DNA的标记和最终PCR循环 238
10．凝胶序列分析………………………………………………………………（240) 241
11．预期结果 241
12．试剂的配制…………………………………………………………………（241) 245
第十八章 脉冲场凝胶电泳和酵母人工染色体解析拟南芥基因组 Callum J.Bell，Emilia Matallana，Patrick J.Dunn，Meiqing Lu，Kenneth Stark和Joseph R.Ecker 245
1．导论…………………………………………………………………………（245) 253
2．酵母DNA的微量制备………………………………………………………（252) 253
3．大肠杆菌质粒拯救法制备YAC插入片段的末端序列 253
4．用反向PCR回收YAC插入片段末端序列 256
5．用PCR筛选YAC文库的序列标志位点 260
6．筛选用于菌落杂交的YAC文库 263
7．用琼脂糖包埋法制备酵母大分子量DNA 267
8．钳位均匀电场电泳分析YACs 268
9．杂交筛选YAC文库 269
10．培养基的配制 271
11．试剂的配制 272
附录1 转基因植物试验规则 277
附录2 材料来源和设备供应商 278
索引 283