目录 1
第一部分 分子克隆 1
第一章 大肠杆菌的基本知识和技术 1
第一节 大肠杆菌的特征及其细胞结构 1
一、大肠杆菌的分类特征 1
二、大肠杆菌的细胞结构 2
第二节 大肠杆菌基因的命名规则 3
一、与代谢有关的结构基因 3
三、与药物或噬菌体抗性有关的基因 3
二、与代谢无直接关系的结构基因 4
四、抑制基因 4
五、染色体结构突变 5
六、其他 6
第三节 大肠杆菌的遗传性和变异性 6
一、大肠杆菌的变异性 6
二、大肠杆菌的菌株及其特性的鉴定 8
三、大肠杆菌菌株的保存方法 10
第四节 大肠杆菌的营养和生长 11
一、大肠杆菌的营养 11
二、大肠杆菌在固体培养基上的生长 12
三、大肠杆菌在液体培养基中的生长 13
第二章 基因工程的载体体系 16
第一节 质粒载体 16
一、细菌质粒的基本概念 16
二、基因工程中质粒载体的选择 20
三、介绍几类质粒载体 23
第二节 λ噬菌体载体 28
一、λ噬菌体的生物学特性 28
二、λ噬菌体载体的构建 33
三、常用的λ载体种类 37
四、λ载体的选择和应用 43
第三章 基因工程中常用的核酸酶类 47
第一节 DNA和RNA连接酶 47
一、T4DNA连接酶 48
二、大肠杆菌DNA连接酶 50
一、大肠杆菌聚合酶Ⅰ 51
第二节 DNA聚合酶 51
三、T4RNA连接酶 51
二、DNA聚合酶的Klenow片段 53
三、T4DNA聚合酶 54
四、逆转录酶 56
五、末端转移酶 58
第三节 磷酸激酶和磷酸酶 60
一、T4多核苷酸激酶 60
二、碱性磷酸酶 63
第四节 核酸水解酶 65
一、外切酶Ⅲ 66
二、S1核酸酶 67
三、绿豆核酸内切酶 68
五、λ外切酶 69
四、外切酶Ⅶ 69
六、Bal31核酸酶 70
七、核糖核酸酶H 72
第五节 甲基化酶 73
一、原核细胞中的甲基化酶 73
二、存在于大肠杆菌K12株中的甲基化酶 74
三、甲基化酶的用法 75
四、甲基化酶的实际应用 76
第四章 分子克隆技术（一） 81
——基因与载体的剪切及重组 81
第一节 重组技术概述 81
一、剪切获取特定的基因片段 81
第二节 基因剪切常用方法 82
一、基因剪切的特点 82
二、载体的选择 82
四、基因与载体的重组 82
三、载体的剪切 82
二、应用限制性内切酶水解基因与载体形成粘末端 83
三、形成带有平末端的基因 88
四、从平末端改造成粘末端 97
第三节 剪切后基因与载体的连接 104
一、带有粘末端的DNA片段之间的连接 105
二、平末端及3′突出末端的连接特点 106
三、基因片段大小与连接的关系 107
四、防止载体自身连接的脱末端磷酸基团 108
六、同聚物加尾后的连接 110
五、连接后限制性内切酶识别位点的恢复 110
第五章 分子克隆技术（二）——重组DNA的转化、筛选和鉴定 111
第一节 重组DNA对大肠杆菌的转化 112
一、氯化钙法 112
二、氯化钙-氯化铷法 113
三、大肠杆菌X1776的转化 114
四、重组DNA克隆的初步筛选 116
第二节 重组DNA克隆的核酸杂交筛选方法 117
一、菌落杂交 117
二、重组噬菌体DNA的杂交筛选 119
第三节 免疫化学筛选方法 120
一、抗体的制备 121
二、抗体的纯化 121
四、溴化氰活化滤纸法 122
三、抗体蛋白质的125Ⅰ标记 122
五、固相筛选法 124
第四节 重组质粒和λ噬菌体DNA的小量快速制备方法 125
一、碱裂解法制备质粒DNA 125
二、煮沸法制备质粒DNA 126
三、从单菌落中制备质粒DNA 127
四、平板裂解法制备λ噬菌体DNA 127
五、液体培养基裂解法制备λ噬菌体DNA 128
第五节 重组DNA的酶切分析和鉴定 129
一、单酶解分析 129
二、双酶解分析 130
三、多次酶解和电泳分析 130
四、部分降解酶切分析 131
五、人工合成探针在鉴定中的应用 132
第六节 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western技术在克隆鉴定中的应用 133
一、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 134
二、电泳转移 136
三、抗体的放射性检测法 137
第六章 基因文库 139
第一节 引言 139
一、基因的分离 139
二、什么是基因文库 140
三、基因文库构建的基本步骤 141
一、染色体DNA的抽提 143
第二节 供体DNA 143
二、染色体DNA的切割 145
第三节 载体DNA 148
一、λ替代型载体的结构特点 149
二、载体DNA的制备 151
三、制备载体的两臂和去除中央片段 152
第四节 重组连接、体外包装和感染方法 154
一、重组连接 154
二、重组噬菌体DNA的体外包装 158
三、重组噬菌体的感染 161
四、基因文库的构建规模 165
五、基因文库的扩增和贮存 166
二、基因文库的构建过程 168
一、考斯质粒作载体的优缺点 168
第五节 考斯质粒为载体的基因文库 168
结语 170
第七章 cDNA克隆 172
第一节 cDNA克隆的一般方法和步骤 173
一、cDNA克隆方法 173
二、cDNA克隆的具体步骤 174
第二节 特异cDNA的克隆 179
一、插入到表达载体中的cDNA克隆的筛选 179
二、选择杂交法筛选特异cDNA克隆 179
三、cDNA克隆操作实例 180
一、cDNA克隆所使用的酶制剂 182
第三节 cDNA克隆应注意的问题 182
二、作为cDNA合成模板的mRNA 183
三、载体DNA 185
四、器械的消毒处理 185
第二部分 基因表达 187
第八章 基因表达与几种表达体系 187
第一节 基因表达的基本原理 188
一、乳糖和色氨酸操纵子的特点及其转录翻译元件 188
二、lac与trp操纵子的基因表达调节 191
三、真核细胞中的基因表达与多级调控 193
第二节 常用的基因表达质粒 194
一、lac启动子的应用 194
二、trp启动子与人工合成tac启动子的应用 196
第三节 翻译框架与融合蛋白 199
三、λ噬菌体中PL与PR两个启动子的应用 199
一、基因表达与翻译框架 200
二、融合蛋白 200
第四节 几种基因表达体系的比较 201
第九章 大肠杆菌体系中的基因表达 202
第一节 真核基因与原核基因在结构和表达调控上的差异 202
第二节 影响真核基因在大肠杆菌体系中表达的因素 203
一、启动子 203
二、基因剂量 205
三、核糖体结合位点 206
五、编码多肽密码子的组成情况 207
四、基因产物的稳定性 207
六、表达产物的构象 208
七、表达产物的分子量大小 208
八、原核增强序列 208
第三节 真核基因在大肠杆菌中表达的方式 209
一、融合基因-融合蛋白 209
二、非融合基因-非融合蛋白 210
三、融合基因-非融合蛋白 211
第四节 真核基因在大肠杆菌体系中的表达设计 211
一、lac启动子 211
二、trp启动子 216
三、tac启动子 219
四、PL启动子 220
六、IPP启动子 225
五、β内酰胺酶启动子 225
第十章 酵母体系中的基因表达 232
第一节 酵母表达系统概述 232
一、载体 232
二、启动子及其他控制序列 234
三、寄主酵母菌株 236
第二节 酵母表达系统的构建 236
一、酵母启动子的提取 236
二、表达载体的构建 239
三、外源基因的引入和表达质粒的构建 243
第三节 酵母体系中的基因表达 248
一、酵母菌的转化 248
二、酵母质粒的检测 250
第十一章 哺乳动物细胞受体系统中的基因表达 255
第一节 哺乳动物细胞表达外源基因概述 256
第二节 哺乳动物细胞表达外源基因的必需条件 256
一、外源DNA或供体DNA 258
二、载体 259
三、重组质粒的改建 260
四、受体细胞 267
五、选择标记和选择培养基 269
六、重组DNA转染细胞 271
七、图示几种转化表达HBsAg的系统 275
附录一、大肠杆菌的常用培养基 279
附录二、大肠杆菌的常用菌株 281
附录三、大肠杆菌遗传学中常见的基因型 282
附图 283