第1章 概述 1
1.1 基因工程的基本概念 1
1.1.1 基因工程的基本定义 1
1.1.2 基因工程的基本过程 1
1.1.3 基因工程的基本原理 2
1.1.4 基因工程的基本体系 2
1.2 基因工程的发展历史 4
1.2.1 基因工程的诞生 4
1.2.2 基因工程的成熟 5
1.2.3 基因工程的腾飞 5
1.3 基因工程的研究意义 6
1.3.1 第四次工业大革命 6
1.3.2 第二次农业大革命 7
1.3.3 第四次医学大革命 7
第2章 DNA重组克隆单元操作 9
2.1 DNA重组的载体 9
2.1.1 质粒载体 9
2.1.2 病毒或噬菌体载体 13
2.1.3 噬菌体-质粒杂合载体 19
2.1.4 人造染色体载体 21
2.2 DNA的体外重组（切与接） 21
2.2.1 限制性核酸内切酶 22
2.2.2 T4-DNA连接酶 26
2.2.3 其他用于DNA重组的工具酶 26
2.2.4 DNA切接反应的影响因素 30
2.2.5 DNA分子重组的方法 34
2.3 重组DNA分子的转化与扩增（转与增） 41
2.3.1 重组 DNA转化的基本概念 42
2.3.2 细菌受体细胞的选择 43
2.3.3 细菌受体细胞的转化方法 44
2.3.4 转化率及其影响因素 47
2.3.5 转化细胞的扩增 48
2.4 转化子的筛选与重组子的鉴定（检） 48
2.4.1 基于载体遗传标记的筛选与鉴定 49
2.4.2 基于克隆片段序列的筛选与鉴定 51
2.4.3 基于外源基因表达产物的筛选与鉴定 66
2.5 目的基因的克隆 68
2.5.1 鸟枪法 68
2.5.2 cDNA法 71
2.5.3 PCR扩增法 79
2.5.4 化学合成法 85
2.5.5 基因文库的构建 88
第3章 大肠杆菌基因工程 93
3.1 外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理 93
3.1.1 大肠杆菌表达系统的启动子 93
3.1.2 大肠杆菌表达系统的终止子 98
3.1.3 大肠杆菌表达系统的核糖体结合位点 99
3.1.4 大肠杆菌表达系统的密码子 100
3.1.5 大肠杆菌表达系统的mRNA稳定性 101
3.1.6 大肠杆菌表达系统的质粒拷贝数 101
3.2 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 102
3.2.1 包涵体型重组异源蛋白的表达 102
3.2.2 分泌型重组异源蛋白的表达 105
3.2.3 融合型重组异源蛋白的表达 108
3.2.4 寡聚型重组异源蛋白的表达 112
3.2.5 整合型重组异源蛋白的表达 116
3.3 重组异源蛋白的体内修饰与体外复性 117
3.3.1 重组异源蛋白的稳定性维持 117
3.3.2 重组异源蛋白的糖基化修饰 119
3.3.3 包涵体型重组异源蛋白的体外溶解与变性 121
3.3.4 包涵体型重组异源蛋白的体外复性与重折叠 122
3.4 大肠杆菌工程菌培养的工程化控制 126
3.4.1 细菌生长的动力学原理 127
3.4.2 发酵过程的最优化控制 129
3.4.3 大肠杆菌工程菌的高密度发酵 131
3.4.4 基因工程菌的遗传不稳定性及其机制 133
3.4.5 改善基因工程菌遗传不稳定性的对策 134
3.5 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 136
3.5.1 胰岛素的结构及其生物合成 137
3.5.2 人胰岛素的生产方法 138
3.5.3 产重组人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略 138
3.6 利用重组大肠杆菌生产人抗体及其片段 141
3.6.1 重组抗体的生产策略 141
3.6.2 由大肠杆菌生产重组抗体片段的优越性 143
3.6.3 产重组抗体片段大肠杆菌工程菌的构建 145
3.6.4 重组抗体及其片段表达产物的分离纯化 149
第4章 原核细菌基因工程 150
4.1 芽孢杆菌基因工程 150
4.1.1 芽孢杆菌的载体克隆系统 150
4.1.2 芽孢杆菌的宿主转化系统 154
4.1.3 芽孢杆菌的基因表达系统 155
4.1.4 芽孢杆菌的分泌折叠系统 161
4.1.5 重组芽孢杆菌在耐热性酶制剂大规模生产中的应用 165
4.1.6 重组芽孢杆菌在人体蛋白药物生产中的应用 169
4.1.7 重组芽孢杆菌在昆虫毒素蛋白生产中的应用 171
4.2 棒状杆菌基因工程 174
4.2.1 棒状杆菌的载体克隆系统 175
4.2.2 棒状杆菌的基因表达系统 179
4.2.3 棒状杆菌的宿主转化系统 183
4.2.4 赖氨酸基因工程菌的构建 184
4.2.5 精氨酸基因工程菌的构建 188
4.3 链霉菌基因工程 192
4.3.1 链霉菌的载体克隆系统 192
4.3.2 链霉菌的宿主转化系统 198
4.3.3 链霉菌的基因表达系统 200
4.3.4 链霉菌的蛋白分泌系统 205
4.3.5 利用重组链霉菌分泌表达哺乳动物蛋白 207
4.3.6 利用DNA重组技术改良抗生素生产菌 208
4.4 梭菌属基因工程 214
4.4.1 梭菌属的载体克隆系统 215
4.4.2 梭菌属的宿主转化系统 221
4.4.3 利用DNA重组技术改良有机溶剂的羧菌生产菌 223
4.4.4 利用DNA重组技术改良羧菌属的纤维素分解酶系 226
4.5 乳酸菌基因工程 228
4.5.1 乳酸菌的载体克隆系统 229
4.5.2 乳酸菌的诱导表达系统 235
4.5.3 乳酸菌的宿主转化系统 236
4.5.4 利用DNA重组技术改良食用乳酸菌 238
4.5.5 利用DNA重组技术构建非食用乳酸菌工程株 242
4.6 假单胞菌基因工程 243
4.6.1 假单胞菌的载体克隆系统 243
4.6.2 假单胞菌的宿主转化系统 245
4.6.3 假单胞菌生物降解基因的克隆与鉴定 246
4.6.4 假单胞菌生物降解途径的分子设计 247
第5章 真菌基因工程 253
5.1 丝状真菌基因工程 253
5.1.1 丝状真菌的载体克隆系统 253
5.1.2 丝状真菌的宿主转化系统 258
5.1.3 丝状真菌的表达分泌系统 262
5.1.4 丝状真菌重组异源蛋白的表达优化策略 267
5.1.5 重组曲霉属在异源蛋白生产中的应用 269
5.1.6 重组丝状真菌在次级代谢物生产中的应用 271
5.2 酵母基因工程 276
5.2.1 酵母的宿主系统 276
5.2.2 酵母的载体系统 279
5.2.3 酵母的转化系统 286
5.2.4 酵母的表达系统 291
5.2.5 酵母的蛋白修饰分泌系统 307
5.2.6 利用重组酵母生产乙肝疫苗 315
5.2.7 利用重组酵母生产人血清白蛋白 316
第6章 昆虫基因工程 320
6.1 果蝇的基因转化系统 320
6.1.1 果蝇转座元件的结构及特征 320
6.1.2 P元件介导的果蝇杂交不育 321
6.1.3 P元件介导的果蝇经典转化程序 322
6.1.4 果蝇体细胞的转化程序与表达系统 324
6.2 蚊虫和农业害虫的基因改造系统 325
6.2.1 用于非果蝇类昆虫转化的载体 326
6.2.2 用于非果蝇类昆虫转化株筛选的标记基因 331
6.2.3 农业害虫的基因工程 332
6.2.4 蚊虫的基因工程 339
6.3 家蚕的基因表达系统 346
6.3.1 家蚕的分子生物学 347
6.3.2 家蚕的杆状病毒基因表达系统 348
6.3.3 家蚕生物反应器的构建 354
6.3.4 抗病毒型转基因家蚕的构建 359
第7章 高等动物基因工程 362
7.1 高等动物细胞的基因转移系统 362
7.1.1 用于基因转移的动物受体细胞 362
7.1.2 动物细胞的物理转化程序 364
7.1.3 动物细胞的化学转化程序 365
7.1.4 动物细胞的病毒转染程序 366
7.1.5 动物细胞的慢病毒载体系统 372
7.2 利用动物转基因技术研究基因的表达与功能 377
7.2.1 基于报告基因探测动物基因组中的调控序列及染色质转录活性状态 377
7.2.2 基于同源重组敲除靶基因或敲入转基因 379
7.2.3 基于位点特异性整合条件性敲除靶基因或敲入转基因 379
7.2.4 基于位点特异性断裂条件性编辑基因组 383
7.2.5 基于序列特异性互补条件性敲低靶基因 386
7.3 利用动物转基因技术生产重组蛋白多肽 389
7.3.1 高等动物转基因的表达特征 389
7.3.2 高等动物转基因的表达元件 391
7.3.3 利用高等动物工程细胞系生产医用蛋白 394
7.3.4 利用高等动物细胞瞬时表达技术生产医用蛋白 399
7.3.5 利用转基因动物的组织或器官生产医用蛋白 401
7.4 利用转基因技术改良动物遗传性状 404
7.4.1 转基因动物生成的原理与技术 404
7.4.2 转基因动物生成的特征与应用 410
7.4.3 转基因动物生成的挑战与前景 416
7.5 基因治疗 416
7.5.1 基因治疗的基本策略 416
7.5.2 间接体内基因治疗 418
7.5.3 直接体内基因治疗 423
7.5.4 基因治疗面临的挑战与对策 428
第8章 高等植物基因工程 430
8.1 高等植物的基因转移系统 430
8.1.1 Ti质粒介导的整合转化 431
8.1.2 植物病毒介导的转染 440
8.1.3 植物的物理转化方法 443
8.1.4 植物细胞的化学转化法 445
8.1.5 植物原生质体的再生 445
8.2 高等植物的基因表达系统 447
8.2.1 植物转基因的启动子／增强子 447
8.2.2 植物转基因的非翻译区 453
8.2.3 植物转基因的编码序列 455
8.2.4 植物转基因的装配 455
8.3 利用植物转基因技术研究基因的表达与调控 457
8.3.1 利用T-DNA或转座子元件原位克隆鉴定植物功能基因 457
8.3.2 利用病毒诱导型基因沉默机制鉴定植物功能基因 459
8.3.3 利用增强子或启动子元件原位激活鉴定植物功能基因 461
8.3.4 利用cDNA或ORF表达序列鉴定植物功能基因 462
8.3.5 利用报告基因展示高等植物基因表达与调控的信息谱 465
8.3.6 利用CRISPR／Cas系统编辑植物基因组 466
8.4 利用转基因技术改良植物品种 466
8.4.1 抗生物胁迫型转基因农作物的生成 468
8.4.2 耐非生物胁迫型转基因农作物的生成 471
8.4.3 提升光合效能型转基因农作物的生成 474
8.4.4 改善品质型转基因农作物的生成 478
8.4.5 转基因农作物的安全性 482
8.5 利用转基因植物或细胞生产重组异源蛋白和工业原料 482
8.5.1 植物生物反应器的构建策略 483
8.5.2 利用植物生物反应器生产医用蛋白 485
8.5.3 利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂 486
8.5.4 利用植物生物反应器生产工业原料 487
第9章 第二代基因工程——蛋白质工程 488
9.1 蛋白质工程的基本概念 488
9.1.1 蛋白质工程的基本特征 488
9.1.2 蛋白质工程的研究内容及应用 489
9.1.3 蛋白质工程实施的必要条件 490
9.2 基因的体外定向突变 490
9.2.1 局部随机掺入法 490
9.2.2 碱基定点转换法 491
9.2.3 部分片段合成法 491
9.2.4 引物定点引入法 494
9.2.5 PCR扩增突变法 496
9.3 基因的体外定向进化 497
9.3.1 易错PCR 497
9.3.2 DNA改组 498
9.3.3 体外随机引发重组 498
9.3.4 交错延伸 501
9.3.5 过渡模板随机嵌合生长 501
9.3.6 渐增切割杂合酶生成 501
9.3.7 同源序列非依赖性蛋白质重组 502
9.3.8 突变文库高通量筛选模型的建立 503
9.4 蛋白质工程的设计思想与应用 505
9.4.1 提高蛋白质或酶类分子的稳定性 505
9.4.2 减少重组多肽链的错误折叠 508
9.4.3 改善酶的催化活性 508
9.4.4 消除酶的被抑制特性 511
9.4.5 修饰酶的催化特异性 511
9.4.6 改造配体与其受体的亲和性 512
9.4.7 降低异源蛋白药物的免疫原性 515
第10章 第三代基因工程——途径工程 518
10.1 途径工程的基本概念 518
10.1.1 途径工程的基本定义 518
10.1.2 途径工程的基本过程 519
10.1.3 途径工程的基本原理 521
10.2 途径工程的研究策略 523
10.2.1 在现存途径中提高目标产物的代谢流 523
10.2.2 在现存途径中改变物质流的性质 523
10.2.3 利用已有途径构建新的代谢旁路 526
10.3 初级代谢的途径工程 527
10.3.1 乙醇生产菌的途径操作 528
10.3.2 辅酶Q生产菌的途径操作 534
10.3.3 氢气生产菌的途径操作 541
10.4 次级代谢的途径工程 542
10.4.1 聚酮生物合成的分子机制 542
10.4.2 聚酮合酶各组成模块的操作策略 542
10.4.3 聚酮生物合成基因的异源表达 545
10.5 信号转导的途径工程 547
10.5.1 信号转导途径的构成与功能 547
10.5.2 信号转导途径的性能修饰 549
10.5.3 信号转导途径的动力学行为修饰 552
参考文献 558