1 引言 1
1.1 细胞培养及肺癌发生 1
第1章 培养中的人肺肿瘤细胞的生长 1
1.2 肺癌细胞生长所需的生长因子和激素 2
2 培养基及试剂的配制 4
2.1 HITES基础培养基的配制 5
2.2 C培养基和C改良培养基的配制 6
3 安全提示 7
4 操作步骤 7
4.1 取材及运送 7
方案1.1 肺肿瘤标本的处理 7
4.2 细胞分离 7
方案1.2 机械研磨法从肺肿瘤组织收集细胞 8
方案1.3 用胶原酶解离肺肿瘤组织 8
方案1.4 SCLC细胞的培养 9
4.3 细胞培养的条件 9
方案1.5 来源于腺癌和大细胞癌的肿瘤细胞的培养 10
方案1.6 肺癌细胞的克隆化培养 11
4.4 致瘤性及分化功能的分析 12
4.5 其他方法 12
5 讨论 13
致谢 14
材料来源 14
参考文献 15
第2章 正常及恶性胃上皮的培养 17
1 引言 17
1.1 胃癌 17
1.2 正常胃上皮 18
3 胃癌细胞的原代培养 19
2.3 肿瘤标本的预处理 19
3.1 实体瘤的培养程序 19
2 胃癌组织原代培养的准备 19
2.2 起始培养基 19
2.1 生长培养基 19
方案2.1 实体胃癌细胞原代培养的准备 20
3.2 腹水培养程序 21
方案2.2 密度梯度离心从腹水中分离胃癌细胞 21
4 癌细胞的富集 21
4.1 悬浮细胞团 22
方案2.3 移出细胞团，富集癌细胞 22
4.2 黏附性集落 22
方案2.4 用机械法使细胞聚集体脱壁富集胃癌细胞 22
方案2.5 刮除法富集胃癌细胞 23
5 癌来源细胞的扩增和保存 24
方案2.6 分步消化法富集胃癌细胞 24
5.1 漂浮细胞聚集体 25
5.2 紧密聚集的细胞团 25
方案2.7 分散细胞聚集体，传代培养胃癌细胞 25
5.3 贴壁细胞 26
方案2.8 贴壁胃癌细胞的传代培养 27
5.4 含有贴壁细胞和悬浮细胞亚群的培养物 27
方案2.9 混合有悬浮胃癌细胞亚群和贴壁胃癌细胞亚群的传代培养 27
6 培养的胃癌细胞系的代表性特征 28
7 国际细胞库中的胃癌细胞系 30
8 正常胃上皮细胞 30
8.1 设备、试剂、培养基制备 30
8.2 组织的获取及安全 34
方案2.10 用胶原酶消化和Percoll分离细胞的方法原代培养人胃黏膜上皮细胞 35
8.3 人体胃黏膜细胞分离和培养 35
方案2.11 利用胶原酶／离散蛋白酶消化，在胶原上接种原代培养人胃黏膜上皮细胞 36
方案2.12 利用胶原酶、链霉蛋白酶、透明质酸酶原代培养胃黏膜上皮细胞 37
8.4 人胚胎胃细胞的分离和培养 39
方案2.13 人胚胎胃细胞的培养 39
8.5 人胃窦细胞的分离和培养 39
方案2.14 人胃窦细胞的分离和培养 39
8.6 胃黏膜细胞培养物的鉴定 41
方案2.15 体外胃上皮细胞生长测定 41
方案2.16 PAS细胞化学鉴定黏蛋白 42
方案2.17 胃细胞黏液的免疫组织化学 42
方案2.18 通过细胞角蛋白染色确认胃细胞 43
方案2.19 用抗胃蛋白酶-Ⅱ和胃H+/K+-ATP酶免疫荧光鉴定胃细胞类型 43
方案2.20 胃上皮培养物的光镜观察 44
方案2.21 胃上皮培养物的电镜观察 45
8.7 正常胃上皮培养物的主要应用 46
致谢 46
材料来源 47
参考文献 48
第3章 结肠癌细胞系的建立 51
1 引言 51
2 培养基及试剂的配制 52
2.1 培养基 52
2.2 消化酶 53
2.3 消毒液 53
2.4 包被胶原 54
方案3.1 包被Ⅰ型胶原用于结肠癌细胞的培养 54
3 用肿瘤活检标本建立细胞系 54
方案3.2 结肠癌肿瘤组织的原代培养 55
3.1 原代培养 55
3.2 传代培养 56
3.3 细胞的冷冻保存 56
3.4 特性鉴定 57
4 取材自腹水的细胞培养 58
方案3.3 来自腹水的结肠癌细胞的培养 58
5 其他方法 58
5.1 饲养层细胞 58
5.2 异种移植 59
5.3 取材自遗传综合征患者的结肠癌细胞的培养 59
6 供应商 59
6.1 培养用塑料器皿 59
6.2 培养基 59
材料来源 59
参考文献 60
第4章 胰腺癌来源的培养细胞：基因改变的研究及在实验性胰腺癌转移模型中的应用 63
1 引言 63
2 细胞系的建立 64
2.1 肿瘤组织的来源 64
2.2 原代培养 64
方案4.1 胰腺肿瘤组织的原代培养 64
方案4.2 来源于腹水的胰腺肿瘤细胞的原代培养 66
3 肝转移实验 67
方案4.3 裸鼠异种移植肿瘤转移实验 67
3.1 肿瘤转移分析结果 68
4 人胰腺癌原位移植模型 69
4.1 手术过程 69
方案4.4 胰腺癌细胞系的原位移植 69
4.2 裸鼠胰腺癌细胞原位移植后的自然病程 69
4.4 移植肿瘤的显微观察 70
4.3 移植肿瘤的肉眼观察 70
5 基因改变 71
5.1 Ki-ras基因突变（密码子12） 71
5.2 p53基因突变 71
5.3 CDKN2 A基因的改变 71
5.4 基因研究的结果 72
材料来源 73
参考文献 74
第5章 体外膀胱癌培养的建立和鉴定 75
1 引言 75
1.1 背景 75
1.2 病理学 75
1.3 方法原理 76
2.1 培养基和盐溶液 77
2 培养基和试剂的准备 77
2.2 胶原包被培养板 78
方案5.1 从鼠尾提取胶原 78
方案5.2 氨重建胶原凝胶底物 79
3 安全提示 80
4 培养 80
4.1 组织的获取 80
4.2 原代培养 80
方案5.3 膀胱肿瘤原代培养 80
4.3 TCC的传代培养 81
方案5.4 原代培养膀胱肿瘤的传代培养 81
4.4 细胞的冷冻和复苏 82
5 转化状态建立的标准 82
6.1 细菌和真菌污染 83
6 常见问题的处理 83
6.2 成纤维细胞污染／生长羸弱 84
6.3 分化 84
7 方法应用 85
8 其他方法学 87
8.1 胶原酶消化 87
方案5.5 胶原酶消化膀胱肿瘤 87
8.2 单细胞悬浮培养和其他培养技术 88
8.3 其他要求 88
9 可供使用的持续性细胞系目录 88
致谢 91
材料来源 91
参考文献 91
1 引言 97
第6章 正常及恶变人前列腺上皮细胞的长期培养 97
2 制备培养基 99
3 获取组织 100
4 处理组织 100
5 原代细胞培养的建立 101
方案6.1 正常、良性及恶性前列腺的原代培养 101
6 原代培养的维持 102
7 原代细胞培养的永生化 103
方案6.2 前列腺上皮细胞培养的永生化 104
7.1 安全提示 104
8 稳定细胞系的特性 105
8.1 杂合缺失的检测 105
方案6.3 前列腺细胞系杂合缺失的检测 105
9 稳定细胞系的维持 106
方案6.4 长期前列腺细胞系的维持 106
方案6.5 永生化前列腺细胞系的冻存 107
10 稳定细胞系的冻存 107
方案6.6 冻存前列腺细胞系的复苏 108
11 应用 108
致谢 109
材料来源 109
参考文献 110
第7章 以实体瘤和腹水建立人卵巢上皮肿瘤细胞系 113
1 引言 113
1.1 胚胎学和组织学 113
1.2 卵巢肿瘤的病理学和病因学 115
1.3 卵巢癌的临床特征 115
1.4 卵巢肿瘤细胞培养和细胞系建立的概述 116
2.3 CMF 117
2.5 胰蛋白酶／EDTA 117
2.4 胰蛋白酶 117
2.2 双倍浓度的Dulbecco's培养基2×DMEM 117
2.1 培养基PPIGSS 117
2 培养基和试剂的准备 117
2.6 DNase 118
2.7 CFA 118
3 肿瘤的收集 118
3.1 伦理许可 118
3.2 收集体系 118
3.3 从手术室收集实体瘤和腹水 118
方案7.1 卵巢肿瘤样品的收集 119
3.4 病理学报告剖析 120
4 原代培养 121
4.1 实体瘤的破碎 121
方案7.2 卵巢肿瘤的机械破碎 122
方案7.3 卵巢肿瘤的冷胰蛋白酶酶解破碎 123
方案7.4 渗透压脉冲（快速吹吸裂解）去除血红细胞 124
方案7.5 密度离心去除血红细胞 124
4.2 去除血红细胞 124
4.3 原代培养的起始 125
方案7.6 卵巢肿瘤细胞的原代培养 125
方案7.7 腹水来源的卵巢癌细胞培养 126
5 原代培养的后续工作 126
5.1 细胞分离 127
方案7.8 用差别酶处理（DET）从混合细胞型黏附培养物中分离细胞 127
5.2 与DET组合的无细胞腹水（CFA）的利用 128
方案7.9 利用单层间皮细胞选择适合于上皮间质分离的腹水 129
方案7.10 从CFA和DET的混合单层细胞中分离卵巢肿瘤细胞 130
6 传代培养 131
7 培养中的细胞鉴定 133
参考文献 136
材料来源 136
第8章 宫颈癌癌细胞系的培养 139
1 引言 139
2 安全注意事项 140
3 培养基及试剂的配制 141
3.1 破碎试剂 141
3.2 培养基 141
3.3 台盼蓝 142
3.4 琼脂克隆试剂 142
4 短期培养的建立 143
方案8.1 宫颈瘤细胞悬液的制备 143
方案8.2 宫颈瘤细胞的软琼脂分析 145
4.1 短期培养物的应用 146
5 长期培养的建立 146
方案8.3 3T3饲养细胞层的生成 146
方案8.4 宫颈瘤原代培养的建立 147
方案8.5 宫颈瘤细胞的传代培养 148
5.1 冷藏 149
5.2 建立长期细胞系的其他方法 149
5.3 肿瘤细胞系的特征 149
6 长期培养物的应用 152
7 结论 155
材料来源 156
参考文献 156
第9章 人类乳腺肿瘤细胞的原代培养 159
1 引言 159
1.1 乳腺癌模型：细胞系 159
1.2 乳腺癌模型：原代培养细胞 159
2.4 原代培养基 160
2.6 Tris缓冲盐溶液（TBS） 160
2.5 完全培养基 160
2.2 器官样培养基（OM） 160
2.3 收集培养基 160
2.1 抗生素溶液（ABC-PBSA） 160
2 培养基及试剂的配制 160
3 乳腺肿瘤细胞的培养 161
方案9.1 胶原酶分散乳腺肿瘤组织 161
方案9.2 已解离的乳腺肿瘤细胞的培养 162
4 鉴定 163
4.1 培养物表型的确定 163
方案9.3 免疫染色确定培养乳腺细胞的表型 163
4.2 流式细胞分析 165
方案9.4 乳腺细胞培养物的流式细胞分析 165
4.3 生长控制 165
5 乳腺癌细胞模型的应用 167
参考文献 168
致谢 168
材料来源 168
第10章 肌上皮细胞：培养和研究方法 171
1 引言 171
2 肌上皮细胞的研究 172
3 肿瘤侵袭的抑制 173
4 肿瘤血管发生的抑制 181
5 生理学和药理学操作 188
6 肌上皮细胞基因产物作为代理终点标记物 188
7 转化的肌上皮细胞 189
8.6 F12/DMEM/H 190
8.10 尿素／盐酸胍提取缓冲液 190
8.9 高盐缓冲液 190
8.8 无血清F12/DMEM/H 190
8.7 解离酶培养基 190
8.4 破碎培养基 190
8.5 胰蛋白酶-EDTA 190
8.3 CMF-HBSS 190
8.2 贴壁培养基 190
8.1 补充的K-SFM 190
8 培养基及试剂的配制 190
8.11 Tris缓冲盐（TBS） 191
9 转化的和正常的人肌上皮细胞培养 191
9.1 转化的肌上皮细胞 191
方案10.1 转化的人肌上皮细胞培养 191
9.2 正常的肌上皮细胞 192
方案10.2 正常的人肌上皮细胞培养 193
9.3 复苏和特征描述 194
方案10.3 人肌上皮细胞基质的制备 196
10 肌上皮细胞基质的获取方法 196
11 未来肌上皮细胞研究的方向 198
材料来源 199
参考文献 199
第11章 多阶段头颈部鳞状上皮细胞癌 201
1 引言 201
2 培养基和试剂的制备 202
2.1 生长培养基 202
2.2 胰蛋白酶／EDTA 203
2.3 经辐射过的3T3（X3T3）细胞饲养层的制备 203
3 肿瘤样品的采集、分期和病理学 203
4 来自SCC-HN和黏膜红斑的细胞培养物 204
方案11.1 头颈部鳞状细胞癌的外植块培养 204
方案11.2 SCC-HN细胞的传代培养 205
方案11.3 黏膜红斑活检组织的冷胰蛋白酶消化法 205
5.2 透射电镜 206
方案11.4 单层角质形成细胞的透射电镜观察 206
5 培养物的特征 206
5.1 鉴定角质形成细胞 206
5.3 角质形成细胞瘤、相应患者淋巴细胞和成纤维细胞的DNA指纹分析 208
5.4 从正常、癌前和恶性鳞状上皮分离的角质形成细胞的增殖能力 209
方案11.5 角质形成细胞在琼脂中的克隆生长 209
5.5 癌前和恶性人类角质形成细胞缺乏对终末成熟信号的反应 212
方案11.6 角质形成细胞终末成熟分析 213
5.6 癌前和恶性人类角质形成细胞的致瘤性 214
方案11.7 在裸鼠上的致瘤性 214
5.7 细胞遗传学 215
方案11.8 癌前和恶性人类角质形成细胞的染色体分析 215
6 讨论和应用 216
参考文献 220
致谢 220
材料来源 220
第12章 正常、良性及恶性黑素细胞的培养 225
1 引言 225
1.1 单纯正常黑素细胞的培养 225
1.2 痣、原发病变和晚期病变来源的黑素细胞 231
1.3 黑素细胞起源的确定 233
2 储存液及培养基的制备 233
2.1 储存液 233
2.2 培养基的配制 235
2.3 组织准备 236
方案12.1 正常人包皮的中性蛋白酶消化 236
方案12.2 人包皮的胰蛋白酶消化 237
方案12.3 来源于痣及原发黑素瘤的黑素细胞培养 238
方案12.6 黑素细胞维持培养 239
方案12.4 来源于晚期病变的黑素细胞培养 239
方案12.5 新霉素（Geneticin,G418）处理去除成纤维细胞 239
2.4 培养方法的变化 240
3 安全提示 240
4 主要应用 241
4.1 基因变异 241
4.2 信号转导和自主生长 241
4.3 恶性肿瘤进展的体内和体外模型 241
4.4 黑素瘤疫苗 242
4.5 移植 242
致谢 242
材料来源 242
参考文献 243
1.1 背景 251
第13章 人类白血病-淋巴瘤细胞系的建立和培养 251
1 引言 251
1.2 方法学原理 252
2 培养基及试剂的配制 254
2.1 培养基 254
2.2 条件培养基 254
方案13.1 用5637细胞制备条件培养基 255
3 细胞系的建立 255
3.1 获得细胞 255
方案13.2 收集样本用于培养白血病／淋巴瘤细胞 256
3.2 分离细胞 256
方案13.3 密度梯度离心法分离单个核细胞 256
3.3 细胞计数 257
3.4 培养条件 257
方案13.4 从白血病／淋巴瘤建立连续细胞系 258
方案13.5 白血病／淋巴瘤细胞和细胞系的细胞学 259
3.5 早期种系细胞的保存 259
3.6 细胞形态学 259
4 细胞系的冷冻和储存 260
4.1 细胞的冷冻 260
方案13.6 白血病／淋巴瘤细胞系的冷冻保存 260
4.2 储存于液相或气相 261
5 细胞系的解冻、扩增和维持 261
5.1 细胞的解冻 261
方案13.7 冻存白血病／淋巴瘤细胞系的解冻 261
5.2 细胞的扩增 262
方案13.8 白血病／淋巴瘤细胞系的扩增 262
5.3 细胞系的维持 263
6 细胞系鉴定和公布 263
6.1 新细胞系的基本要求 263
6.2 细胞系的鉴定 265
6.3 细胞系的分类 267
7 生物安全性 268
8 评述 269
8.1 一般情况下要考虑的因素 269
8.2 培养环境 269
8.3 细胞培养的常见问题 270
8.4 时间上的考虑 270
材料来源 271
参考文献 272
第14章 恶性脑肿瘤的体外培养 275
1 引言 275
1.1 恶性脑肿瘤的发病率、组织学和预后 275
1.2 恶性脑肿瘤的细胞培养 276
2.2 培养基和血清 278
2.1 活检组织的采集和处理 278
2 培养基及试剂的配制 278
2.3 酶 279
2.4 其他试剂 279
3 短期培养的方法 279
3.1 胶原酶分解取材的单层细胞培养 279
方案14.1 胶原酶分解与脑肿瘤的原代培养 280
3.2 其他分解离散方法 281
3.3 小的外科手术活检组织的移植培养 281
方案14.2 脑肿瘤的原代移植培养 281
3.4 其他移植物培养方法 281
3.5 换液、传代和污染试验 282
方案14.3 源于原代培养的脑肿瘤细胞的传代 282
方案14.4 脑肿瘤培养物的支原体筛查 284
方案14.6 脑肿瘤培养物的细胞浆抗原的免疫染色方法 285
4.1 细胞浆抗原的染色 285
方案14.5 脑肿瘤培养物的冷冻保存 285
4 脑肿瘤培养物抗原表型的测定 285
4.2 细胞核抗原的染色 286
方案14.7 脑肿瘤培养物的细胞核抗原的免疫染色方法 286
4.3 细胞表面抗原的染色 287
方案14.8 脑肿瘤培养物的细胞表面抗原的免疫染色方法 287
5 安全提示 288
致谢 289
材料来源 289
参考文献 290
第15章 人神经内分泌肿瘤细胞的培养 293
1 引言 293
2.3 D-多聚赖氨酸包被培养容器 294
2.2 从成纤维细胞中分离肿瘤细胞的胶原酶培养基 294
2.1 转运培养基 294
2 试剂和材料 294
2.4 生长培养基 295
2.5 用于细胞遗传学分析的生长培养基 295
2.6 无血清的培养基（改进Brower等人的技术） 295
3 肿瘤标本的收集和冻存 295
3.1 肿瘤标本的收集 296
方案15.1 神经内分泌肿瘤标本的收集 296
3.2 活检标本的冷冻 296
方案15.2 神经内分泌肿瘤活检标本的冻存 296
4 原代培养 297
方案15.3 神经内分泌肿瘤标本的原代外植块培养 297
方案15.4 机械分散神经内分泌肿瘤标本的原代培养 298
5 长期培养和连续细胞系 299
方案15.7 培养的神经内分泌细胞的低温储藏 300
6 培养细胞的低温储藏 300
方案15.5 非贴壁细胞系传代培养 300
方案15.6 去除神经内分泌培养物中的成纤维细胞 300
7 特性鉴定 301
7.1 免疫细胞化学 301
方案15.8 培养的神经内分泌细胞的免疫细胞化学 301
7.2 电子显微镜术 303
方案15.9 神经内分泌培养物的透射电子显微术 304
方案15.10 神经内分泌培养物的扫描电子显微术 305
7.3 细胞遗传学分析 306
方案15.11 贴壁的和悬浮的神经内分泌细胞的染色体分析 307
7.4 MTC细胞系的致瘤性检测 307
方案15.12 神经内分泌肿瘤细胞在裸鼠体内的致瘤性 307
8.2 特性 308
8.1 建立细胞系 308
8 结果和应用 308
8.3 抗癌药物筛选 311
8.4 凋亡 311
8.5 治疗 312
9 细胞库里已建立的细胞系 312
9.1 美国模式培养物保藏所（ATCC） 312
9.2 欧洲细胞培养物保藏所（ECACC） 312
致谢 312
材料来源 313
参考文献 315
缩写词表 319
附录 供应商名录 325
索引 341