第一章 基因工程概述 1
第一节 基因操作与基因工程 1
一、基因操作与基因工程的关系 1
二、基因工程的诞生与发展 2
第二节 基因工程是生物科学发展的必然产物 4
一、基因是基因重组的物质基础 4
二、DNA的结构和功能 5
三、基因操作技术的发展促进基因工程的诞生和发展 7
第三节 基因的结构——基因操作的理论基础 9
四、基因工程的内容 9
一、基因的结构组成对基因操作的影响 10
二、基因克隆的通用策略 11
第一篇 基因操作原理 15
第二章 分子克隆工具酶 15
第一节 限制性内切酶 15
一、限制与修饰 15
二、限制酶识别的序列 18
三、限制酶产生的末端 19
四、DNA末端长度对限制酶切割的影响 23
六、酶切反应条件 24
五、位点偏爱 24
七、星星活性 26
八、单链DNA的切割 26
九、酶切位点的引入 26
十、影响酶活性的因素 27
十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性 27
第二节 甲基化酶 28
一、甲基化酶的种类 28
二、依赖于甲基化的限制系统 28
第三节 DNA聚合酶 29
三、甲基化对限制酶切的影响 29
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 30
二、Klenow DNA聚合酶 31
三、T4噬菌体DNA聚合酶 31
四、T7噬菌体DNA聚合酶 32
五、耐热DNA聚合酶 32
六、反转录酶 32
七、末端转移酶 33
第四节 其他分子克隆工具酶 33
一、依赖于DNA的RNA聚合酶 33
二、连接酶 34
四、碱性磷酸酶 35
五、核酸酶 35
三、T4多核苷酸激酶 35
六、核酸酶抑制剂 36
七、琼脂糖酶 37
八、DNA结合蛋白 37
九、其他酶 37
第三章 分子克隆载体 39
第一节 质粒载体 39
一、质粒的基本特性 39
二、标记基因 41
三、质粒载体的种类 43
一、λ噬菌体的分子生物学 46
第二节 λ噬菌体载体 46
二、λ噬菌体载体的选择标记 51
三、代表性λ噬菌体载体 52
四、λ噬菌体载体的克隆原理及步骤 57
第三节 单链丝状噬菌体载体 60
一、M13噬菌体的生物学 60
二、M13噬菌体载体 62
三、M13噬菌体载体的宿主菌 64
四、丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题 66
五、噬菌粒 67
六、M13KO7辅助噬菌体 68
第四章 人工染色体载体 70
第一节 黏粒载体 71
一、黏粒的结构特征和用途 71
二、黏粒载体的工作原理 71
三、黏粒克隆载体 72
四、黏粒文库的扩增和贮存 75
五、构建黏粒文库应注意的问题 75
第二节 酵母人工染色体载体 76
一、YAC载体的复制元件和标记基因 77
二、YAC载体的工作原理 77
二、BAC载体工作原理 79
一、BAC载体及其结构组成 79
第三节 细菌人工染色体载体 79
第四节 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体 80
一、P1噬菌体的分子遗传特征 80
二、P1噬菌体载体 81
三、P1人工染色体载体 84
第五章 表达载体 86
第一节 大肠杆菌表达载体 86
一、大肠杆菌表达载体的结构 86
二、利用T7噬菌体启动子的表达载体 88
三、表达融合蛋白的表达载体 90
四、表达产物的纯化 93
一、大肠杆菌／革兰氏阳性细菌穿梭载体 94
第二节 穿梭载体 94
二、大肠杆菌／酵母菌穿梭载体 95
三、其他穿梭载体 95
第三节 整合载体 95
一、基因插入／基因敲除 95
二、随机插入突变载体 96
第六章 基因操作中大分子的分离和分析 100
第一节 DNA的分离、检测和纯化 100
一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化 100
二、DNA的琼脂糖凝胶电泳 102
三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 102
四、脉冲场凝胶电泳 103
五、DNA片段的纯化 104
第二节 RNA的分离、检测和纯化 105
一、控制潜在RNA酶的活性 105
二、RNA的抽提和纯化 106
三、mRNA的纯化 106
四、RNA的电泳检测 107
第三节 分子杂交 107
一、Southern杂交 108
二、Northern杂交 108
三、Western杂交 108
五、探针的标记 109
四、其他分子杂交 109
一、RNA的S1核酸酶作图 112
二、S1核酸酶作图分析mRNA的端点 112
第四节 RNA作图和端点分析 112
三、引物延伸法分析mRNA的端点 113
第五节 重组DNA分子导入大肠杆菌 115
一、CaCl2转化法 115
二、电转化法 115
第七章 基因芯片技术 118
第一节 生物芯片简介 118
一、生物芯片的定义 118
三、基因芯片技术的发展史 119
二、基因芯片分析流程 119
四、基因芯片技术的特点 120
第二节 生物芯片的分类 120
一、按载体材料分类 120
二、按点样方式分类 120
三、按芯片固定的生物分子类型分类 121
四、按芯片使用功能分类 121
第三节 基因芯片的制作 122
一、DNA样品的来源 122
二、生物芯片的制作方法 123
三、制作生物芯片常用的工具 124
四、DNA分子在刚性表面的固定 125
第四节 基因芯片的杂交及结果分析 126
一、探针的标记 126
二、杂交 127
三、芯片结果读取与扫描仪 128
四、生物芯片的软件系统与数据处理 128
第五节 基因芯片的应用 129
一、基因表达分析 129
三、杂交测序 130
四、核酸和蛋白质相互作用的研究 130
二、基因型及多态性分析 130
五、疾病的诊断与治疗 131
六、药物开发 131
七、在营养与食品卫生领域的应用 131
八、在环境科学领域中的应用 131
第八章 PCR技术及其应用 133
第一节 PCR技术原理和工作方式 133
一、PCR的基本原理 133
二、PCR反应体系 134
三、PCR反应程序 137
第二节 PCR产物的克隆 138
一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点 138
二、A/T克隆法 139
三、平末端DNA片段的克隆 140
四、长片段DNA的PCR扩增 142
第三节 PCR扩增未知DNA片段 142
一、反向PCR 143
二、利用接头的PCR 144
三、热不对称交错PCR 144
第四节 与反转录相关的PCR 146
一、cDNA末端的快速扩增 146
二、差异显示PCR 148
一、多重PCR 149
第五节 PCR产生DNA指纹 149
二、随机扩增多态性DNA 150
三、扩增片段长度多态性 150
第六节 实时定量PCR 151
一、实时荧光定量PCR的定量方式 151
二、荧光标记方式 152
第九章 DNA序列分析 155
第一节 Maxam-Gilbert化学降解法 155
一、基本原理 155
二、化学降解测序法的基本步骤 155
一、基本原理 157
第二节 Sanger双脱氧链终止法 157
四、化学降解测序法的应用 157
三、化学修饰试剂 157
二、序列分析的基本步骤 160
三、序列分析的工作模式 161
第三节 DNA片段序列测定的策略 163
一、通用引物指导未知序列的测定 163
二、引物步移 163
三、随机克隆测序 163
四、缺失克隆测序 164
一、序列分析和生物信息学的应用 165
二、基因数据库和分析工具 165
分析 165
第四节 核苷酸序列的生物信息 165
第十章 DNA诱变 168
第一节 随机诱变 168
一、错误掺入诱变 169
二、盒式诱变 170
三、增变菌株的诱变作用 171
四、化学诱变 171
第二节 DNA体外重组 173
一、DNA洗牌法 173
二、交错延伸重组 174
三、随机引发重组 175
第三节 寡核苷酸介导的定点诱变 176
一、寡核苷酸介导定点诱变的基本流程 176
二、诱变寡核苷酸的设计 176
三、经典DNA定点诱变 177
四、PCR介导的定点诱变 178
五、野生型DNA的筛选排除 182
第四节 嵌套缺失 183
一、嵌套缺失的制备 183
二、嵌套缺失的应用 184
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选 187
第一节 基因组DNA文库的构建 188
一、基因组DNA文库的类型和发展 188
二、文库的代表性和随机性 189
三、基因组DNA文库的构建流程 190
第二节 cDNA文库的构建 192
一、cDNA文库的特征和发展 192
二、cDNA文库的构建 193
三、cDNA文库均一化处理 198
四、扣除杂交cDNA文库 199
五、全长cDNA文库 202
六、其他cDNA文库 203
第三节 基因克隆的筛选策略 205
一、表型筛选法 206
二、杂交筛选和PCR筛选 206
三、免疫筛选 206
四、酵母双杂交系统 207
五、克隆基因的验证和分析 208
第四节 DNA文库的保存 208
第一节 基因组遗传图谱的构建 211
一、遗传作图标记 211
第十二章 基因组研究技术 211
二、遗传作图的方法 212
第二节 基因组物理图谱的构建 213
一、限制性作图 213
二、DNA大片段重叠克隆的基因组作图 213
三、荧光标记原位杂交作图 214
四、序列标签位点作图 214
第三节 基因组测序 215
一、大规模基因组测序方法学改进 215
二、基因组DNA序列的确定 215
第四节 基因组功能分析 220
一、鉴定基因组序列中的基因 220
三、人类基因组测序 220
二、基因功能的确定 221
三、基因组功能体现 222
第五节 基因组工程 223
一、基于Cre-loxP重组系统的基因组工程 223
二、病毒基因组工程 223
第二篇 基因工程应用 229
第十三章 植物基因工程 229
第一节 植物基因工程的发展现状 229
第二节 植物基因工程方法 230
一、原生质体介导法 231
二、基因枪法 233
三、根癌农杆菌介导法 235
四、基因枪法与根癌农杆菌介导法的比较 239
第三节 转化子细胞的筛选 240
一、植物基因工程中的选择基因 240
二、报告基因 240
第四节 转化体的鉴定与证实 241
一、PCR检测外源基因的整合 242
二、Southern杂交检测外源基因的整合 242
三、RT-PCR检测外源基因的表达 242
第五节 植物基因工程研究的应用和展望 243
一、抗性基因工程 243
四、Northern杂交检测外源基因的表达 243
五、Western杂交检测外源基因表达的产物 243
二、植物品质改良基因工程 246
三、植物杂种优势的利用 247
四、植物代谢工程 247
第十四章 动物基因工程 249
第一节 动物基因工程的发展现状与趋势 249
一、转基因方法的升级换代 250
二、转基因动物打破了传统的农业生产格局 251
第二节 转基因动物技术 252
一、动物基因工程载体 252
三、转基因动物及其产品的生物安全性 252
二、基因转移技术 260
第三节 转基因动物制备 262
一、转基因动物的制备程序 262
二、转基因鉴定 266
三、表达水平检测 268
四、转基因动物传代与检测 269
第四节 转基因动物的应用与未来 270
一、转基因动物的应用 270
二、转基因动物的生物安全性 271
三、动物转基因的未来 272
一、酵母基因工程的优点 274
第十五章 酵母基因工程 274
第一节 酵母基因工程的发展现状和发展趋势 274
二、酵母基因工程的发展现状 275
三、酵母基因工程的发展趋势 276
第二节 酵母表达系统 277
一、酵母表达系统概述 277
二、常用酵母表达系统 279
第三节 酵母基因工程的应用 285
一、酵母基因工程的应用情况 285
二、酵母基因工程的应用举例 287
一、细菌基因工程的发展简史 290
二、细菌基因工程的发展现状 290
第一节 细菌基因工程的发展现状和发展趋势 290
第十六章 细菌基因工程 290
三、细菌基因工程的发展趋势及前景展望 292
第二节 细菌基因工程的表达系统 293
一、细菌基因工程的表达系统 293
二、表达载体构建原则 293
三、外源基因表达的方式 294
四、常见细菌表达系统 295
第三节 细菌基因工程的应用 298
一、农业领域的基因工程细菌 298
二、食品和工业基因工程菌 302
三、重组DNA技术生产医用抗生素 307
四、环境微生物基因工程菌的应用 309
第十七章 病毒基因工程 314
第一节 病毒载体 315
一、动物病毒载体 315
二、植物病毒载体 323
三、噬菌体载体 324
第二节 病毒与基因工程 324
一、基因工程病毒疫苗 325
二、病毒与基因治疗 326
三、病毒与生物防治 328
第十八章 医药基因工程 333
第一节 基因工程药物的开发状况 333
一、基因工程药物的分类 333
二、基因工程药物的发展 334
三、基因工程药物的产业化状况 335
第二节 基因工程蛋白和多肽药物 336
一、基因工程胰岛素 336
二、基因工程人红细胞生成素 337
三、基因工程干扰素 338
四、基因工程疫苗 339
一、抗体的结构 341
第三节 基因工程抗体 341
五、基因工程抗体 341
二、天然抗体的局限性 342
三、基因工程抗体的种类 343
第四节 核酸类药物 346
一、反义核酸药物 346
二、核酸疫苗 348
三、RNA干扰 350
四、基因治疗 351
第一节 基因工程产品的安全性争论 354
一、DNA重组的安全性争论 354
第十九章 基因工程产品的安全及其管理 354
二、基因工程产品的安全性争论 355
三、与基因工程产品的安全性有关的重要事件 355
第二节 基因工程产品与人类 356
一、基因工程产品与人类健康 356
二、基因工程产品与农业生产 357
三、基因工程产品与生态平衡 357
第三节 基因工程产品的安全性管理 357
一、基因工程产品的安全性管理类型 358
二、中国基因工程产品的安全性管理 358
第四节 基因工程技术及其产品的发展前景 359
索引 361