目录 1
实验计划表 1
导论 4
1 基因文库的构建 18
1-1 染色体DNA的提取 18
1-2 总RNA和mRNA的提取 25
1-3 λ噬菌体DNA的提取 33
1-4 染色体DNA的部分消化 38
1-5 基因组文库的构建 40
1-6 cDNA合成 44
1-7 cDNA文库的构建 49
2 目的基因的获得 55
2-1 PCR扩增及RT-PCR 55
2-2 核酸电泳 64
2-3 核酸探针的标记及检测 69
2-4 核酸探针筛选基因文库 77
3 载体质粒的制备 82
3-1 质粒DNA的提取与纯化 82
3 2 核酸纯度、浓度与相对分子质量的测定 90
4 扩增质粒的构建 94
4-1 限制性内切酶的酶切反应 94
4-2 凝胶电泳法进行DNA的分离、提纯 100
4-3 DNA片段的体外连接 103
5 重组DNA导入宿主细胞 107
5-1 感受态细胞的制备 107
5-2 重组质粒的转化 111
6-1 阳性克隆的筛选 117
6 重组子的筛选与鉴定 117
6-2 测序与序列同源性分析 122
6-3 Southern印迹 127
7 表达质粒的构建与诱导表达 134
7-1 表达质粒的构建 134
7-2 Northern印迹 140
7-3 外源基因的诱导表达 145
7-4 SDS-PAGE 149
7-5 Western印迹 155
7-6 酶联免疫吸附测定（ELISA） 160
7-7 蛋白质生物功能测定法 162
8 工程菌的培养与目标产物分离 164
8-1 发酵条件的优化 164
8-2 诱导表达蛋白质的分离沉淀 166
8-3 凝胶过滤层析 172
8-4 离子交换层析 180
8-5 蛋白质浓度的测定 186
8-6 酶活性的测定 189
8-7 分离纯化蛋白的收率计算与保存 191
参考文献 193
附录1 简写 194
附录2 实验注意事项 197
附录3 如何撰写实验报告 199
附录4 常用的碱基、氨基酸符号及缓冲液 201
附录5 大肠杆菌基因型 204
附录6 培养基与试剂的配制 205
附录7 实验仪器 212