1 绪论 1
1.1 基因及其结构 2
1.1.1 基因与性状 2
1.1.2 原核生物基因结构 3
1.1.3 真核生物基因结构 4
1.2 基因表达调控 6
1.2.1 原核生物基因表达调控 6
1.2.2 真核生物基因表达调控 8
1.2.3 基因表达调控的生物学意义 17
1.3 基因工程及其研究内容 18
1.3.1 基因工程概念 18
1.3.2 研究内容 18
1.4 基因工程发展简史 19
1.4.1 基因工程的理论支撑 19
1.4.2 基因工程工具酶与载体的发现 19
1.4.3 基因工程的诞生 20
1.4.4 基因工程技术的发展 20
1.5 基因工程应用展望 21
1.5.1 基因工程表达技术的发展 21
1.5.2 带有新性状的转基因生物的创造 21
1.5.3 基因工程新产品的问世 21
1.5.4 数量性状的基因工程改良与基因组工程 21
1.5.5 基因检测与基因治疗的应用 21
1.5.6 基因工程安全性的提高 22
2 基因工程载体 23
2.1 概述 24
2.1.1 基因工程载体的概念 24
2.1.2 基因工程载体的分类 25
2.1.3 基因工程载体的遗传选择标记 25
2.2 质粒 25
2.2.1 概述 25
2.2.2 质粒的类型 26
2.2.3 基因工程中常用的质粒 26
2.3 λ噬菌体载体 28
2.4 柯斯载体 30
2.5 噬菌体质粒 31
2.6 单链DNA噬菌体载体 32
2.7 酵母载体 32
2.8 真核病毒载体 33
2.8.1 牛乳头瘤病毒载体 33
2.8.2 猿猴空泡病毒载体 33
2.8.3 反转录病毒载体 34
2.8.4 痘病毒载体 35
2.9 昆虫杆状病毒载体 35
3 基因操作的工具酶 37
3.1 DNA操作酶的类型 38
3.2 DNA限制性内切酶 38
3.2.1 DNA限制性内切酶的发现与命名 39
3.2.2 DNA限制性内切酶的识别序列与切割产物 39
3.2.3 DNA限制性内切酶的酶切反应 40
3.3 连接酶 40
3.3.1 DNA连接酶的种类 41
3.3.2 DNA末端（黏末端和平末端）连接 41
3.3.3 RNA连接酶 41
3.4 DNA聚合酶 42
3.4.1 大肠杆菌DNA聚合酶I与Klenow酶 42
3.4.2 Taq DNA聚合酶 43
3.4.3 T4噬菌体DNA聚合酶 43
3.4.4 T7噬菌体DNA聚合酶 43
3.4.5 末端转移酶 43
3.5 反转录酶 44
3.5.1 AMV反转录酶 44
3.5.2 M-MLV反转录酶 44
3.5.3 HIV-1反转录酶 44
3.6 核酸酶 45
3.6.1 核酸内切酶 45
3.6.2 核酸外切酶 46
3.6.3 其他核酸酶 47
3.7 DNA修饰酶 47
3.7.1 DNA激酶 47
3.7.2 DNA甲基转移酶 47
3.7.3 磷酸酶 48
3.8 重组酶 49
3.8.1 Cre重组酶 49
3.8.2 Hin重组酶 49
3.8.3 RecA/RAD51 50
3.8.4 Tre重组酶 50
3.8.5 Flp重组酶 50
3.9 DNA修复酶 50
3.9.1 DNA糖苷酶 50
3.9.2 损伤修复相关的核酸内切酶 52
4 DNA的提取与纯化 55
4.1 质粒DNA的制备 56
4.1.1 质粒DNA制备的基本原理 56
4.1.2 质粒DNA制备的常见方法 58
4.2 噬菌体DNA的制备 61
4.2.1 λ噬菌体DNA的分离纯化 61
4.2.2 M13噬菌体DNA的分离纯化 62
4.3 基因组DNA的制备 63
4.3.1 细菌基因组DNA的制备 63
4.3.2 植物基因组DNA的制备 64
4.3.3 哺乳动物基因组DNA的制备 65
4.4 DNA的定量和纯度测定 66
4.4.1 紫外光谱分析法 66
4.4.2 荧光分光光度法 66
4.4.3 琼脂糖凝胶电泳检测法 67
5 基因检测与分析 69
5.1 DNA 测序技术 70
5.1.1 Sanger链终止法测序 71
5.1.2 Illumina（Solexa）测序 71
5.1.3 454焦磷酸测序Ion Torrent半导体测序 73
5.1.4 SOLiD测序 74
5.1.5 单分子测序 76
5.2 新一代测序技术的基础计算分析 78
5.2.1 无参考序列的从头拼接 79
5.2.2 有参考序列的快速序列比对 80
5.3 DNA序列高级分析 81
5.3.1 DNA序列分析的步骤 82
5.3.2 重复序列辨别 82
5.3.3 同源性搜索 83
5.3.4 基因结构特征分析 85
5.3.5 基于基因序列进化分析 88
5.4 基因检测技术 91
5.4.1 PCR技术 91
5.4.2 印迹与杂交 95
5.5 功能基因组学分析 97
5.5.1 转录组分析技术 97
5.5.2 蛋白质组分析技术 100
5.5.3 翻译组测序技术 103
6 目的基因的获得 105
6.1 基于PCR的目的基因克隆方法 106
6.1.1 已知完整核苷酸序列的目的基因的获取 106
6.1.2 已知完整氨基酸序列的目的基因的获取 108
6.1.3 已知部分序列的目的基因的获取 108
6.2 化学合成目的基因 110
6.3 文库法获得目的基因 113
6.3.1 cDNA文库的合成 113
6.3.2 从cDNA文库中筛选和鉴定目的基因 115
6.4 差异克隆技术 116
6.4.1 mRNA差别显示技术 116
6.4.2 代表性差异分析 118
6.4.3 抑制性消减杂交 119
7 体外基因诱变 121
7.1 随机突变 124
7.1.1 易错PCR诱变 124
7.1.2 盒式诱变 125
7.1.3 重组介导的随机诱变 128
7.1.4 缺失诱变 132
7.1.5 插入诱变 134
7.1.6 限制性内切酶介导的诱变 137
7.1.7 化学诱变 138
7.2 定点突变 139
7.2.1 PCR介导的定点诱变 140
7.2.2 不依赖PCR的定点诱变 142
8 重组DNA分子转入大肠杆菌 147
8.1 大肠杆菌的转化 148
8.1.1 大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒转化 148
8.1.2 对转化细胞的选择 150
8.1.3 重组体的鉴定 151
8.2 噬菌体DNA转染细菌细胞 157
8.2.1 λ噬菌体体外包装 157
8.2.2 单链噬菌体转染 160
8.2.3 重组噬菌体的筛选方法 165
9 真核生物基因调控技术 167
9.1 基因过量表达技术 169
9.1.1 启动子的选择 170
9.1.2 Kozak序列 170
9.1.3 密码子偏爱性 171
9.1.4 增强子、前导序列与沉默子 172
9.2 基因沉默技术 173
9.2.1 反义RNA技术 173
9.2.2 RNAi技术 174
9.2.3 基因共抑制技术 176
9.3 基因编辑技术 177
9.3.1 基因敲除技术 177
9.3.2 基因敲入技术 180
9.3.3 TALENs基因靶向修饰 181
9.3.4 CRISPR/Cas9技术 182
10 细菌基因工程 185
10.1 目的基因在大肠杆菌中的表达 186
10.1.1 外源基因表达载体 186
10.1.2 表达盒与基因融合 193
10.1.3 在大肠杆菌中表达重组蛋白存在的问题 195
10.2 细菌基因工程的应用 197
10.2.1 基因工程药物 197
10.2.2 酶制剂 199
10.2.3 氨基酸 200
10.2.4 生物基有机酸、醇 200
10.3 其他细菌基因工程 201
10.3.1 芽胞杆菌基因工程 201
10.3.2 棒状杆菌基因工程 203
10.3.3 链霉菌基因工程 204
10.3.4 乳酸菌基因工程 204
11 真菌基因工程 207
11.1 目的基因在酵母中的表达 209
11.1.1 常用的酵母表达载体 209
11.1.2 酵母宿主 214
11.1.3 在酵母中表达重组蛋白存在的问题 216
11.2 酵母转化与表达产物鉴定 216
11.3 酵母基因工程应用 219
11.4 其他真菌基因工程 219
12 植物基因工程 223
12.1 植物基因工程基本原理 224
12.1.1 植物基因的改造及表达载体构建 224
12.1.2 植物基因转化 227
12.1.3 转基因植物的鉴定 232
12.1.4 常用的选择标记与报告基因 232
12.1.5 植物安全表达系统 233
12.2 植物基因工程应用 234
12.2.1 改良农产品品质 234
12.2.2 植物抗虫基因工程 235
12.2.3 抗除草剂基因工程 235
12.2.4 改进逆境适应性 235
12.2.5 植物抗病基因工程 236
12.2.6 提高农作物产量 237
12.2.7 植物生物反应器与产品开发 237
12.3 植物基因工程产品种植现状 238
13 动物基因工程 241
13.1 动物基因工程基本原理 242
13.1.1 动物基因工程的分类 242
13.1.2 动物基因工程载体 246
13.2 基因工程动物的制备 248
13.2.1 受精卵原核显微注射法 249
13.2.2 利用胚胎干细胞的基因打靶法 250
13.2.3 体细胞核移植法 251
13.2.4 病毒介导的转基因 252
13.3 基因工程动物的鉴定 252
13.3.1 基因组水平的检测 253
13.3.2 转录水平的检测 253
13.3.3 蛋白质表达水平的检测 254
13.4 动物细胞基因工程 255
13.4.1 动物细胞表达系统特征 255
13.4.2 表达载体的结构元件 256
13.4.3 人工构建哺乳动物细胞表达载体的原则 257
13.4.4 常用的动物细胞表达系统 257
13.4.5 动物细胞转染方法 257
13.5 动物基因工程应用 258
13.5.1 生命科学探索与疾病防治研究的平台 258
13.5.2 异种器官移植的来源 259
13.5.3 改良动物品种，推动畜牧养殖业发展 259
13.5.4 促进功能性食品、药品的生产 260
14 病毒基因工程 263
14.1 病毒载体 264
14.1.1 病毒载体概述 264
14.1.2 动物病毒载体 265
14.1.3 植物病毒载体 270
14.2 病毒基因工程应用 273
14.2.1 基因工程病毒疫苗 273
14.2.2 病毒与基因治疗 276
14.2.3 病毒与生物防治 278
14.3 病毒基因工程展望 279
15 基因工程产品的分离纯化与检测 281
15.1 原材料的预处理与粗分离 282
15.1.1 细胞破碎 282
15.1.2 粗分离技术 284
15.2 层析分离纯化技术 285
15.2.1 亲和层析技术 286
15.2.2 其他层析技术 289
15.3 终产品的制备与检测分析 290
15.3.1 终产品的制备与储存 290
15.3.2 分离纯化过程中蛋白质检测 290
15.3.3 终产物的检测项目与方法 290
15.4 基因工程产品胰岛素分离纯化与检测实例 292
16 基因工程产品的安全评价与管理 295
16.1 基因工程产品的安全性 297
16.1.1 基因工程产品的食品安全性 297
16.1.2 基因工程产品的生态安全性 298
16.1.3 基因工程与伦理道德 300
16.1.4 基因工程与动物福利 302
16.2 基因工程产品的安全评价 303
16.2.1 基因工程产品的安全评价原则 303
16.2.2 基因工程食品安全性评价 304
16.2.3 基因工程生态安全性评价 306
16.3 基因工程产品的安全管理 307
16.3.1 国际生物安全管理模式 307
16.3.2 中国基因工程产品的安全管理体系 308
主要参考文献 312