第一篇 激光扫描共聚焦显微镜基本原理 3
第一章 激光扫描共聚焦显微镜原理 3
第一节 概述 3
一、共聚焦方法的发展 3
二、激光扫描共聚焦显微镜的结构 5
三、共聚焦显微镜图像模式 6
第二节 标本制备和图像采集 11
一、物镜 11
二、荧光探针 13
三、自发荧光 14
四、图像采集 15
五、故障排除 16
六、图像处理和出版 17
第三节 相关资讯 17
第二章 图像采集 19
一、三维图像构建 19
二、材料 20
三、方法 22
一、测量前的准备工作 29
第三章 激光扫描共聚焦显微镜的测量 29
二、深度和厚度测量 30
三、长度、面积和体积的测量 31
四、荧光强度的测量 32
第四章 图像的三维重建 35
一、材料 35
二、方法 35
第五章 图像的信息管理 41
一、数据库的类型 41
二、图像数据的存储 42
三、数据库的建立 43
四、图像保存以及图像格式 44
第六章 图像变形技术和数字电影 46
一、材料 46
二、方法 48
三、注意事项 51
第七章 细胞体积的原位动态测量 53
一、材料 53
二、方法 54
三、注意事项 63
一、钙代谢简述 67
第一节 钙的转运及其机制 67
第二篇 激光扫描共聚焦显微镜应用 67
第八章 钙转运的机制和细胞内钙的测定 67
二、血钙的转运及其调节 68
三、细胞钙及其转运 70
四、钙与细胞代谢反应调节 75
第二节 细胞内钙的测定 76
一、化学荧光指示剂 77
二、生物发光钙指示剂 80
三、指示剂负载方法 81
四、钙指示剂的定标和估计 83
五、Ca2+指示剂的潜在问题及解决办法 85
六、测量Ca2+的技术 87
七、测量Ca2+的步骤及注意事项 88
第九章 分泌作用的钙离子控制 90
第一节 细胞外分泌机制 90
一、SNARE假说 90
二、Ca2+和Ca2+粘结蛋白在调节分泌中的作用 90
四、胞内钙池 91
五、钙依赖分泌 91
三、Ca2+通道 91
第二节 研究分泌的方法 92
一、完整细胞、渗透细胞和无细胞系统 92
二、单个细胞 92
第三节 分泌过程中胞内Ca2+测定 93
一、完整细胞 93
二、渗透细胞和无细胞系统 95
第四节 分泌时胞内钙测量 97
一、平均Ca2+浓度 97
二、限定亚细胞区域的Ca2+浓度 98
第十章 细胞亚组分的分离和细胞内钙库研究 99
第一节 非肌细胞 99
一、Ca2+库的位置 99
二、Ca2+库的纯化技术 100
三、Ca2+库的性质 105
第二节 肌细胞 107
一、Ca2+库的定位 107
二、Ca2+库的纯化技术 107
三、Ca2+库的性质 109
一、Ca2+信号的胞内成分 112
第一节 钙信号 112
第十一章 研究钙信号的蟾蜍卵母细胞 112
二、Ca2+释放 113
三、钙诱导的钙释放 113
四、用蟾蜍属卵母细胞研究钙信号的优点 114
第二节 钙信号的控制 114
一、肌浆网钙－ATP酶（SERCA）和钙信号 114
二、钙释放控制和钙网硬蛋白摄取 115
三、钙释放的线粒体控制 116
第三节 蟾蜍属卵母细胞系统的实际操作方法 117
一、材料 121
第十二章 细胞内pH及pCa测定 121
二、方法 122
第十三章 钙调蛋白依赖蛋白激酶的激活 125
第一节 钙调蛋白依赖蛋白激酶 126
一、钙调蛋白激酶 126
二、钙调蛋白激酶的三维结构 127
三、CaM结合于钙调蛋白激酶 128
四、CaM的C端结构域与蛋白激酶疏水端保守序列的相互作用 128
五、CaM的124位蛋氨酸调节钙调蛋白激酶的活性 129
七、CaM依赖激酶与CaM之间的氢键和静电作用对CaM依赖激酶活化的调节 130
六、CaM的N端结构域中疏水残基对不同CaM依赖性蛋白激酶的影响 130
一、CaM与CaM结合肽相互作用的Ca2+依赖性 131
二、酶结合的Ca2+依赖和CaM的激活 131
第二节 Ca2+在CaM依赖的蛋白激酶调节中的作用 131
第十四章 钙通道的分子生物学 134
第一节 克隆储存操纵通道的策略 134
第二节 果蝇TRP和TRPL蛋白的同族体 135
一、RT-PCR识别哺乳动物TRP同族体 135
二、通过数据库分析识别TRP相关基因 136
四、哺乳动物TRP蛋白的初级结构和跨膜结构 138
三、TRP蛋白的多样性 138
五、TRP同族体的组织特异性表达 139
六、哺乳动物TRP通道功能性表达相关的方法 142
第十五章 海胆受精成像 143
一、材料 143
二、方法 144
第十六章 完整胚胎活细胞共聚焦成像 148
第一节 材料和方法 148
一、材料 148
二、方法 149
三、注意事项 151
第二节 激光扫描共聚焦显微镜在哺乳动物胚胎发育研究方面的应用 155
第十七章 用荧光探针进行基因表达分析 157
一、材料 158
二、方法 158
第十八章 果蝇荧光原位杂交单标和双标方法 164
一、材料 164
二、方法 165
一、材料 170
第十九章 用蛋白荧光标记技术进行活体共聚焦分析 170
二、方法 171
三、注意事项 175
第三篇 荧光探针及其应用技术 179
第二十章 荧光探针的发展简史 179
第一节 荧光染色和荧光探针 179
一、荧光染色 179
二、荧光的发射原理 179
三、荧光与荧光物质的分子结构 179
第二节 染料的合成及荧光染料的早期应用 180
四、荧光探针 180
第三节 荧光探针在活细胞中的应用和发展 181
第四节 体内荧光探针 182
第二十一章 荧光探针的性质及滤光片的选择 183
第一节 荧光探针的性质 183
一、激发波长和发射波长 183
二、荧光强度 183
三、荧光寿命 183
四、光稳定性 183
六、染料分子对环境的敏感性 184
五、染料分子间的相互作用 184
第二节 滤光片的选择 185
一、常用的光源 185
二、滤光片的分类 185
三、滤光片的选择原则 186
第三节 荧光抗衰减剂的选择 190
一、常用的抗荧光衰减剂 190
二、抗荧光衰减（淬灭）试剂盒 191
第二十二章 荧光探针及其染色技术 193
第一节 荧光探针负载（染色）原则及注意事项 193
二、显微注射法 194
一、酯化荧光探针染色法 194
第二节 常用的染色方法 194
三、透膜剂法 195
第三节 常用荧光探针的染色方法 195
一、BCECF测定pH值 195
二、SNARF-1定量比率测定pH值 195
三、Indo-1测定细胞内Ca2+ 195
七、Rhodamine 123标记活细胞线粒体 196
六、DiBAC4测定细胞膜电位 196
五、CFDA测定细胞间通讯 196
四、Fluo-3测定细胞内Ca2+ 196
八、AO显示RNA和DNA 197
九、PI显示DNA 197
第四节 荧光探针的校正 197
第二十三章 常用荧光探针 198
第一节 测定细胞活性的荧光探针 198
一、细胞活性和细胞毒性试剂盒 198
二、活细胞探针 200
三、死细胞探针 202
第二节 膜荧光探针 203
一、膜脂的特点和膜探针的应用 204
二、膜流动性测定的荧光探针 204
三、荧光基团标记的磷脂 205
四、阴离子膜探针 213
五、阳离子膜探针 219
六、其他非极性和双亲性膜探针 223
第三节 细胞器探针 227
一、线粒体探针 228
二、溶酶体、酵母菌液泡和其他酸性细胞器探针 238
三、内质网和高尔基复合体探针 241
第四节 pH荧光探针 246
一、近中性pH应用的探针 246
二、酸性pH使用的探针 251
三、pH探针交联物 253
第五节 细胞骨架蛋白荧光探针 255
一、肌动蛋白荧光探针 256
二、微管蛋白和其他细胞骨架蛋白探针 266
第二节 激光扫描共聚焦显微镜常用的荧光探针 271
一、选择荧光探针的一般考虑 271
二、使用荧光探针的注意事项 271
第二十四章 荧光探针的选择和应用 271
第一节 选择荧光探针的注意事项 271
一、细胞内游离钙 272
二、DNA和RNA 272
三、膜电位 272
六、细胞间通讯 273
七、细胞膜流动性 273
八、细胞亚微结构（细胞器）探针 273
五、细胞内活性氧 273
四、pH值 273
九、标记抗体、配体等常用的荧光探针 274
十、检测酶活性的荧光探针 274
第三节 激光扫描共聚焦显微镜中荧光探针的使用 274
一、购买荧光探针的一般考虑 275
二、探针选择 275
三、荧光探针到达后的保存 276
四、将荧光探针制备成溶液 276
五、探针溶液的储存 277
六、做好背底检查 277
八、荧光信号的检测 278
七、标记 278
九、光漂白 279
十、环境影响因素 280
十一、仪器因素 280
十二、以FITC作为LSCM探针的例子 281
第四节 使用花青类染料进行LSCM荧光双标记 281
第二十五章 常用组织学技术 283
第一节 免疫荧光组织化学细胞和组织标本的制备 283
一、细胞标本的取材 283
一、固定的目的 284
二、固定剂 284
第二节 细胞和组织的固定 284
二、组织标本的取材 284
三、固定方法 286
第三节 组织切片技术 287
一、冰冻切片 287
二、石蜡切片 288
三、振动切片 288
四、塑料切片 288
一、一般光学显微镜术 289
第四节 常用组织学研究方法 289
七、玻片处理和涂胶 289
六、碳蜡切片 289
五、超薄切片 289
二、几种特殊显微镜的应用 290
三、组织化学和细胞化学术 291
四、免疫细胞化学术 291
五、放射性核素示踪术 292
六、原位杂交术 293
七、细胞和细胞化学定量术 293
九、组织培养术 294
八、电子显微镜术 294
十、细胞融合术 295
第二十六章 免疫荧光细胞化学技术 296
第一节 有关的免疫学基础理论 297
一、抗原、抗体的概念及抗原抗体的关系 297
二、抗原的性质和种类 297
三、抗体的性质和种类 298
四、抗原与抗体的反应 299
五、抗体形成的机制 300
一、直接法 301
第二节 免疫荧光细胞化学的基本原理 301
六、补体系统 301
二、间接法 302
三、补体法 302
四、双重免疫荧光标记法 302
五、对照实验 303
第三节 荧光抗体的制备 303
一、荧光素 303
二、荧光素标记抗体的方法 304
三、荧光抗体质量控制 307
一、标本制作 309
二、荧光抗体染色方法 309
四、荧光抗体的保存 309
第四节 免疫荧光细胞化学染色方法 309
三、荧光抗原染色法 310
第五节 荧光显微镜检查法 311
一、荧光显微镜 311
二、荧光显微镜标本制作要求 313
三、使用荧光显微镜的注意事项 313
二、消除非特异性染色的方法 314
一、非特异性染色的主要因素 314
四、荧光图像的记录方法 314
第六节 非特异性染色的消除方法 314
第二十七章 亲合组织化学技术 317
第一节 抗生物素－生物素免疫细胞化学染色法 317
一、基本原理 317
二、几种抗生物素－生物素染色法 317
第二节 葡萄球菌蛋白A（SPA） 319
一、SPA的性质 320
二、SPA的应用 320
三、SPA在免疫细胞化学染色中的应用 321
二、凝集素的应用 322
第三节 凝集素 322
一、凝集素的特性 322
三、凝集素在免疫细胞化学中的应用 324
四、HRP标记凝集素及凝集素抗体的制备 325
第四节 免疫细胞化学技术的某些进展 326
第四篇 共聚焦显微镜技术在植物学研究中的应用 329
第二十八章 植物细胞样品制备 329
第一节 植物细胞的特点 329
一、细胞壁 329
一、材料 330
第二节 材料和方法 330
二、液泡 330
三、叶绿体 330
二、方法 332
第二十九章 植物细胞骨架研究 339
第一节 植物细胞中细胞骨架结构的共聚焦显微镜观察 339
一、植物微管阵列的观察 339
二、植物微丝骨架的共聚焦显微镜观察 340
第二节 植物细胞骨架动态的共聚焦显微镜观察 341
一、荧光类似物细胞化学法 341
三、植物细胞骨架的三维图像构建 341
二、荧光漂白恢复技术 342
第三节 绿色荧光蛋白（GFP）与共聚焦显微镜观察 343
第四节 植物材料共聚焦显微镜观察的制片方法 343
一、植物材料制片中需注意的问题 343
二、植物材料的制片步骤 344
附录一 细胞生物学名词解释 348
附录二 免疫细胞化学常用试剂及其配制方法 352
参考文献 365
彩 图 373