目录 1
前言 1
第一章 绪论 1
第一节 基因工程的概念 1
第二节 基因工程的诞生与发展 2
一、基因工程诞生的理论基础 2
二、基因工程的诞生 3
三、基因工程的发展 4
第三节 基因工程研究的主要内容 5
一、基因工程研究的主要内容 5
二、基因工程的基本操作程序 7
三、基因工程的基本操作内容 7
第四节 基因工程的意义与发展前景 8
一、基因工程研究的意义 8
二、基因工程发展前景 8
本章小结 8
思考题 9
第二章 基因工程工具酶 10
第一节 限制性核酸内切酶 10
一、宿主的限制和修饰现象 10
二、限制性核酸内切酶的类型 11
三、限制性核酸内切酶的命名 12
四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 13
五、Ⅱ型限制性核酸内切酶的反应条件 17
六、影响限制性核酸内切酶活性的因素 18
第二节 DNA连接酶 20
一、概念与机理 20
二、DNA连接酶的种类 22
三、DNA连接酶的反应体系 23
四、影响连接反应的因素 23
第三节 DNA聚合酶 24
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 25
二、Klenow片段 26
三、T4噬菌体DNA聚合酶 27
四、T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶 28
五、Taq DNA聚合酶 28
六、逆转录酶 29
第四节 末端脱氧核苷酸转移酶 29
第五节 核酸酶 30
一、核糖核酸酶 30
二、脱氧核糖核酸酶Ⅰ 32
三、S1核酸酶 32
第六节 核酸外切酶 33
一、大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ 34
二、大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ 34
三、Bal 31核酸酶 35
第七节 T4噬菌体多核苷酸激酶 35
一、T4噬菌体多核苷酸激酶的性质 35
二、多核苷酸激酶的用途 37
第八节 碱性磷酸酶 37
一、碱性磷酸酶的性质 37
二、碱性磷酸酶的用途 37
本章小结 38
思考题 40
第三章 基因工程载体 41
第一节 质粒载体 41
一、质粒的一般生物学特性 41
二、理想质粒载体的必备条件 44
三、质粒载体的构建 45
四、常用的质粒载体类型 48
第二节 λ噬菌体载体 52
一、λ噬菌体的生物学特性 52
二、λ噬菌体载体的构建 53
三、常用的λ噬菌体载体 55
第三节 单链DNA噬菌体载体 57
一、M13噬菌体的生物学特性 57
二、M13噬菌体载体的构建 58
三、M13噬菌体载体的主要用途 59
四、噬菌粒载体 60
第四节 黏粒载体 60
一、黏粒载体的基本特点 61
二、黏粒载体的构建 62
三、黏粒载体在基因克隆中的应用 62
四、常用的黏粒载体及应用 63
第五节 其他载体 64
一、人工染色体 64
二、植物基因工程载体 65
三、动物基因工程载体 68
第六节 表达载体 74
一、表达载体构建的一般原则 74
二、植物表达载体 77
本章小结 82
思考题 83
第四章 核酸操作的基本技术 84
第一节 核酸的提取与纯化 84
一、基本原理 84
二、微生物DNA的提取 86
三、动物细胞DNA的提取 88
四、植物细胞核DNA的提取 90
五、核外DNA的提取 92
六、RNA的提取 94
第二节 核酸的检测与保存 97
一、核酸的检测 97
二、核酸的保存 100
第三节 核酸的凝胶电泳 101
一、琼脂糖凝胶电泳 101
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 103
三、脉冲电场凝胶电泳 104
第四节 核酸分子杂交 104
一、探针的制备 105
二、核酸杂交 106
本章小结 109
思考题 109
第五章 聚合酶链式反应 110
第一节 聚合酶链式反应扩增原理 110
第二节 聚合酶链式反应体系 112
一、聚合酶链式反应操作程序 112
二、聚合酶链式反应的成分 112
三、聚合酶链式反应的条件 114
第三节 聚合酶链式反应引物设计原则 115
一、引物设计的一般原则 116
二、引物3＇端的末位碱基 116
三、引物设计软件 116
第四节 聚合酶链式反应技术类型 118
一、已知DNA序列的聚合酶链式反应扩增 118
二、逆转录聚合酶链式反应 120
三、已知cDNA一端序列获得全长cDNA的聚合酶链式反应 121
四、已知侧翼序列聚合酶链式反应扩增 123
五、未知序列聚合酶链式反应扩增 125
六、定量聚合酶链式反应 128
七、免疫相关聚合酶链式反应 128
八、聚合酶链式反应技术衍生的分子标记 129
第五节 聚合酶链式反应技术应用 129
一、核酸的基础研究 130
二、序列分析 130
三、检测基因表达 130
四、从cDNA库中放大特定序列 131
五、研究已知片段邻近基因或未知DNA片段 131
六、进化分析 131
七、医学应用 131
八、分析生物学证据 132
九、性别控制 132
十、转基因检测 132
本章小结 133
思考题 133
第六章 基因文库的构建与目的基因的获得 134
第一节 真核基因组DNA文库的构建 134
一、用于构建基因组文库的载体 134
二、基因组DNA克隆片段的制备 137
三、重组DNA分子的构建 138
四、重组DNA分子导入受体细胞 139
五、基因文库的大小及代表性 140
六、基因文库的扩增、分装及保存 140
第二节 cDNA文库的构建 141
一、mRNA的提取及其完整性的确定 141
二、cDNA克隆载体的选择 143
三、cDNA克隆片段的获得 143
四、cDNA克隆的操作流程 147
五、cDNA克隆片段的分析 148
六、完整cDNA文库的生成 148
七、cDNA文库的扩增、分装及保存 148
第三节 目的基因的获得 149
一、对已知序列基因的分离 149
二、对未知序列基因的分离 151
三、基因的人工合成 153
本章小结 153
思考题 154
第七章 DNA体外重组与基因转移 155
第一节 重组DNA分子的构建 155
一、重组DNA的概念 155
二、载体DNA与外源基因片段的连接 156
第二节 基因转移 162
一、重组DNA向细菌细胞转入 163
二、外源目的基因向真核细胞转入 164
本章小结 166
思考题 166
第八章 重组子的筛选与鉴定 167
第一节 遗传学检测法 168
一、根据载体表型特征的筛选 168
二、根据插入基因遗传性状的筛选 169
第二节 核酸分子杂交检测法 170
一、菌落印迹原位杂交 170
二、斑点印迹杂交 170
三、Souithern印迹杂交 171
第三节 物理检测法 171
一、直接凝胶电泳检测法 171
二、限制性核酸内切酶酶切片段分析法 172
第四节 免疫化学检测法 172
一、放射性抗体检测法 173
二、免疫沉淀检测法 173
三、Western印迹分析法 174
第五节 核酸序列分析及其他方法 174
一、核酸序列分析 174
二、PCR法 174
三、Northern印迹分析 174
本章小结 175
思考题 175
第九章 外源基因的表达 176
第一节 外源基因在大肠杆菌中的表达 176
一、正确表达的基本条件 177
二、常用的大肠杆菌表达载体 177
三、外源蛋白质表达部位 183
四、提高外源基因表达效率的方法 184
五、表达产物的检测 188
六、表达实例：人生长素基因在大肠杆菌中的表达 188
第二节 真核细胞表达系统概述 191
一、酵母表达体系 191
二、昆虫细胞表达体系 192
三、哺乳动物细胞表达体系 193
本章小结 194
思考题 194
第十章 微生物基因工程 195
第一节 细菌基因工程 195
一、实现外源基因表达的基本操作 196
二、大肠杆菌工程菌的构建策略 198
三、基因工程菌遗传不稳定性及其对策 208
四、细菌表达异源蛋白的流程 211
第二节 酵母菌基因工程 212
一、酵母菌宿主系统 212
二、酵母菌的载体系统 214
三、酵母菌的转化系统 218
四、酵母菌的表达系统 218
五、酵母菌的蛋白修饰分泌系统 220
第三节 其他微生物系统在基因工程中的利用 222
一、芽孢杆菌在基因工程中的应用 223
二、棒状杆菌在基因工程中的应用 226
三、假单胞杆菌在基因工程中的应用 226
四、链霉菌在基因工程中的应用 226
第四节 微生物基因工程的应用 227
一、重组微生物工程菌与人类药物生产 227
二、重组微生物工程菌与疫苗生产 231
三、重组微生物工程菌与食品、饲料工业 234
四、重组微生物工程菌与环境保护 238
五、重组微生物工程菌与农业生产 240
本章小结 245
思考题 246
第十一章 植物基因工程 248
第一节 农杆菌及其转化体系 248
一、根癌农杆菌的生物学特征 248
二、Ti质粒的结构和功能 249
三、Ti质粒的转化机理 250
四、Ti质粒载体的改造与表达载体的构建 253
五、Ri质粒载体系统 256
第二节 目的基因的导入 256
一、植物转化的受体系统及其考虑因素 257
二、基因的导入方法 258
第三节 外源基因的表达、检测与遗传特性 264
一、转基因植物外源基因的表达及其调控 264
二、外源基因的检测 267
三、转基因植物的遗传特性 269
第四节 植物基因工程的应用 270
一、植物基因工程在植物分子生物学研究中的应用 270
二、改良植物品种 273
三、转基因植物作为生物反应器 277
本章小结 281
思考题 282
第十二章 动物基因工程 284
第一节 动物基因工程的概念与发展 284
第二节 动物目的基因的选择与表达载体的构建 285
一、动物转基因操作的一般程序 285
二、目的基因的选择 286
三、表达载体的构建 287
四、外源基因的组织特异性表达 293
第三节 基因导入的方法 293
一、DEAE-葡聚糖转染法 293
二、显微注射法 294
三、病毒转染法 295
四、胚胎干细胞介导法 296
五、精子载体法 297
六、基因同源重组法 297
第四节 转基因动物的鉴定 299
一、DNA水平的检测 299
二、RNA水平的检测 300
三、目的蛋白的检测 301
第五节 动物基因工程技术的应用 301
一、动物基因工程技术的应用 301
二、动物转基因技术存在的问题 307
三、提高转基因动物外源基因表达水平的方法与途径 308
四、转基因动物的应用前景 311
第六节 基因诊断 311
一、基因诊断的基本方法 312
二、基因芯片与疾病诊断 313
第七节 基因治疗 314
一、基因治疗概述 314
二、基因治疗的方式 315
三、基因治疗的前景 318
本章小结 318
思考题 319
第十三章 分子标记及基因芯片技术与应用 320
第一节 分子标记技术和应用 320
一、分子标记的概念 320
二、分子标记的类型 321
三、标记系统在应用时的选择 331
四、分子标记的应用 334
第二节 基因芯片技术和应用 336
一、概念 336
二、基因芯片类型 337
三、基因芯片的实验操作 338
四、基因芯片的应用 339
五、使用基因芯片时应注意的问题 340
本章小结 342
思考题 342
第十四章 差异显示技术及其应用 343
第一节 mRNA差异显示技术 343
一、mRNA差异显示的基本原理 343
二、mRNA差异显示实验的基本过程 344
三、差异显示方法的优缺点 345
四、差异显示的应用 345
第二节 扣除杂交技术 346
第三节 代表性差异分析技术 349
一、代表性差异分析技术原理 350
二、代表性差异分析技术主要步骤 350
三、代表性差异分析技术的优缺点 350
第四节 抑制性衰减杂交技术 350
一、原理 350
二、抑制性衰减杂交操作程序 352
三、抑制性衰减杂交的优缺点 353
第五节 基因表达系列分析 353
一、基本原理 353
二、操作步骤 354
三、基因表达系列分析的优缺点 355
第六节 差异显示技术的应用 355
一、分析基因表达差异 355
二、寻找遗传标记 355
三、绘制染色体表达图谱 356
四、分离特异表达的基因 356
五、检查cDNA文库的质量 356
六、鉴定种属特异性 356
七、临床诊断遗传疾病 357
本章小结 357
思考题 357
第十五章 生物信息学 358
第一节 生物信息学概论 358
一、蛋白质和核酸序列的测定 358
二、生物大分子空间结构的测定 359
三、生物学信息的迅猛增长 359
四、生物信息学的基本概念及研究内容 360
五、生物信息学研究的热点领域 361
第二节 生物信息数据库 363
一、核酸序列数据库 363
二、蛋白质序列数据库 369
三、大分子空间结构数据库 373
四、基因组数据库 376
第三节 数据的查询和提交 377
一、Entrez查询系统 377
二、SRS数据库查询系统 379
三、数据提交 384
第四节 序列比对和数据库搜索 384
一、序列比对原理 384
二、Blast 387
第五节 多序列比对及系统发育分析 389
一、多序列比对分析 389
二、系统发育分析 390
本章小结 394
思考题 394
第十六章 基因工程规则、专利及安全性 395
第一节 基因工程研究实验室安全性基本要求 395
第二节 基因工程产品的释放规则及要求 396
一、基因工程药物投放的规则和要求 396
二、转基因植物品种的释放要求 397
三、ISO认证 398
第三节 现代生物技术专利 399
一、专利申请的要求 400
二、现代生物技术专利类型 401
三、专利的地域性 401
四、专利与基础研究 402
第四节 现代生物技术的社会伦理问题 402
第五节 基因工程产品的安全性问题 403
一、环境安全性 403
二、转基因食品安全性 404
本章小结 405
思考题 406
主要参考文献 407