目录 1
第一章 显微技术 1
第一节 显微观察 1
一、相差显微镜 1
【实验1-1】相差显微镜的使用 2
二、荧光显微镜 5
【实验1-2】荧光显微镜的使用 8
三、电子显微镜 8
【实验1-3】细菌、酵母菌超薄切片的透射电镜观察 12
【实验1-4】噬菌体的透射电镜观察 14
【实验1-5】质粒DNA的透射电镜观察 15
【实验1-6】酵母细胞的扫描电镜观察 18
第二节 显微摄影 20
【实验1-7】显微摄影、菌落摄影和凝胶摄影 21
第三节 放射自显影 25
【实验1-8】硝酸纤维素滤纸上标记DNA的放射自显影 25
第四节 显微操作技术用于单细胞分离 27
【实验1-9】显微操纵仪用于单细胞分离 29
【实验1-10】显微操纵仪用于酵母子囊的解剖及子囊孢子单孢化 30
【实验1-11】玻璃微型工具的制作 31
第二章 微生物细胞特殊结构的观察 33
第一节 染色技术 33
一、染色的基本原理 33
二、染料 34
三、染色 36
【实验2-1】真菌的荧光染色与观察 36
第二节 细胞主要结构成分的分离与观察 38
【实验2-2】革兰阳性细菌细胞壁的制备 39
【实验2-3】酵母细胞壁甘露聚糖的制备 41
【实验2-4】细胞壁的形态观察 42
【实验2-5】革兰阴性菌细胞外膜蛋白的分离 43
【实验2-6】细菌荚膜的观察 44
【实验2-7】细菌鞭毛的观察 45
【实验2-8】微生物细胞核的观察 47
【实验2-9】细菌染色体DNA的分离与观察 49
【实验2-10】异染颗粒的观察 51
【实验2-11】酵母细胞内脂肪颗粒和肝糖颗粒的观察 52
【实验2-12】酵母液泡及线粒体的提取 54
一、芽孢 57
第三节 芽孢、子囊孢子和假菌丝的观察 57
【实验2-13】细菌芽孢形成及发芽的观察 59
【实验2-14】伴孢晶体的观察 60
二、酵母子囊孢子 61
【实验2-15】酵母子囊孢子的形成及观察 63
【实验2-16】酵母单倍体的分离与鉴定 64
三、酵母假菌丝 66
【实验2-17】酵母假菌丝的观察 66
第三章 噬菌体 69
【实验3-1】噬菌体的分离与纯化 72
【实验3-2】高效价噬菌体原液的制备 74
【实验3-3】溶源菌的鉴定 75
【实验3-4】抗噬菌体产α-淀粉酶菌株的选育 77
第四章 标记菌种的获得与应用 79
第一节 富集培养技术在获得标记菌种中的应用 79
一、营养缺陷型富集法在原核细胞中的应用 79
二、营养缺陷型富集法在真核细胞中的应用 81
三、浓度梯度法富集抗性突变株 82
四、富集法在研究次级代谢的重组DNA技术中的应用 84
第二节 营养缺陷型标记菌种的获得 84
三、检出缺陷型 85
一、诱变方法 85
二、淘汰野生型 85
四、营养缺陷型生长谱的确定 87
【实验4-1】芽孢杆菌营养缺陷型的筛选 89
【实验4-2】酵母营养缺陷型的筛选 91
【实验4-3】青霉菌营养缺陷型菌株的筛选 92
第三节 呼吸缺陷型标记菌种的获得 94
【实验4-4】酵母呼吸缺陷型的筛选 94
第四节 抗反馈调节抗性突变株的获得与应用 95
【实验4-5】氨基酸抗反馈调节突变株的选育 98
第一节 工业菌种育种的策略 101
第五章 原生质体系列育种技术 101
第二节 原生质体融合育种 102
一、原生质体融合育种的特点 103
二、原生质体融合育种步骤与要点 107
三、原生质体再生率和融合率的计算 115
【实验5-1】芽孢杆菌的原生质体融合 115
【实验5-2】链霉菌原生质体融合 119
【实验5-3】小单胞菌的原生质体融合 124
【实验5-4】酿酒酵母的原生质体融合 125
【实验5-5】丝状真菌的原生质体融合 128
第三节 原生质体转化育种 134
【实验5-6】芽孢杆菌原生质体转化 134
【实验5-7】质粒DNA转化链霉菌原生质体 137
【实验5-8】酿酒酵母的原生质体转化法 138
【实验5-9】真菌原生质体转化 139
第四节 原生质体诱变育种 141
【实验5-10】芽孢杆菌种间融合子F-26-2原生质体诱变育种 142
【实验5-11】紫外线诱变原生质体选育L-谷氨酸高产菌 143
一、紫外线照射原生质体增加融合率 145
第五节 原生质体技术中的一些特殊技术 145
二、供体原生质体的热灭活 146
三、原生质体电融合技术 147
【实验5-12】电诱导酵母原生质体融合 147
四、遗传转移 148
【实验5-13】原生质体融合法转移酵母线粒体及杀伤质粒 148
第六章 基因工程育种技术 151
第一节 基因工程的基本过程和原理 151
一、载体 152
二、DNA重组用酶 154
三、宿主细胞 155
四、外源DNA 156
第二节 大肠杆菌基因工程 160
一、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 160
【实验6-1】用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌（Ⅰ） 161
【实验6-2】用氯化钙制备感受态大肠杆菌（Ⅱ） 162
【实验6-3】用PEG制备和转化大肠杆菌感受态细胞 163
【实验6-4】大肠杆菌的电击转化 164
二、大肠杆菌中质粒的提取与纯化 166
【实验6-5】质粒的大量提取与纯化 166
【实验6-6】质粒的小量提取 168
【实验6-7】用硅胶膜分离法小量提取质粒 169
三、微生物染色体DNA的提取与PCR扩增 170
【实验6-8】枯草杆菌染色体DNA的提取 170
【实验6-9】真菌染色体DNA的简易提取方法 171
【实验6-10】枯草杆菌淀粉酶基因的PCR扩增 173
【实验6-11】从电泳凝胶中分离枯草杆菌淀粉酶基因 174
四、外源基因在大肠杆菌中的高表达 175
【实验6-12】载体和基因的酶切 180
【实验6-13】基因与载体的连接 180
第三节 非大肠杆菌微生物基因工程 184
一、芽孢杆菌基因工程 185
【实验6-14】枯草杆菌感受态细胞的制备和转化 186
【实验6-15】地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化 187
【实验6-16】枯草杆菌转化子质粒的提取和检测 188
【实验6-17】高碱性蛋白酶基因多拷贝重组菌的构建 190
二、酵母基因工程 194
【实验6-18】酵母染色体DNA的提取 196
【实验6-19】酿酒酵母的乙酸锂完整细胞转化法 197
【实验6-20】单链载体DNA的制备 198
【实验6-21】酵母菌质粒DNA的提取 199
【实验6-22】巴斯德毕赤酵母的电转化方法 200
【实验6-23】羟酸还原异构酶基因多拷贝重组啤酒酵母的构建 201
第七章 微生物细胞固定化方法 205
第一节 载体结合法 206
一、表面吸附法 206
二、共价结合法 207
第二节 交联法 208
第三节 包埋法 208
一、海藻酸钙凝胶包埋法 209
【实验7-1】酿酒酵母的海藻酸钙固定化 211
【实验7-2】固定化枯草杆菌连续生产耐热α-淀粉酶 213
二、κ-角叉胶包埋法 215
【实验7-3】κ-角叉胶一步包埋法 215
【实验7-4】κ-角叉胶二步包埋法 217
【实验7-5】固定化酵母连续生产酒精 218
【实验7-6】固定化细胞的回收与活细胞计数 219
三、聚丙烯酰胺凝胶包埋法 219
【实验7-7】大肠杆菌的聚丙烯酰胺凝胶固定化 220
四、光交联树脂前聚体包埋法 221
【实验7-8】光交联树脂固定化原生质体 221
五、其他载体包埋方法 222
第四节 几种固定化细胞方法联用 224
一、包埋-交联法 224
二、吸附-交联法 225
三、包埋-吸附法 225
第五节 其他固定化方法 225
第六节 固定化微生物细胞方法的选择 226
一、固定化微生物细胞方法的选择 226
二、固定化细胞技术的评价指标 227
第七节 微生物细胞固定化技术前景展望 227
主要参考文献 229